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目的 杭白菊在种植过程中有明显的连作障碍,实践中用我们自制的蚕沙发酵肥可以有效缓解其连作障碍,为弄清原因,我们从杭白菊生产量、根际土壤理化性质、根际土壤微生物以及杭白菊各器官内生细菌4个方面揭示不同处理组对连作杭白菊的影响和作用,以阐明杭白菊连作障碍缓解的微生态作用机制。方法 1、采用野外大田试验,一共设置了6个实验组,分别为连作组、轮作组、发酵肥组、不发酵肥组、市售菌肥组、石灰组。2、将蚕沙与土壤按一定比例混合进行发酵后,用Miseq测序技术检测发酵后的蚕沙与未发酵前的蚕沙中细菌群落结构特征,比较两者的差异,找到优势菌属和特异菌群。3、在收获期统计各个组杭白菊的存活率、株高、分枝数、产量,同时分析土壤理化性质如pH、无机肥、有机质含量、土壤酶活性。4、在收获期采集处理组杭白菊的根、茎、叶,用T-RFLP检测分析内生细菌的差异性。5、用末端标记限制性片段长度多态性技术(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)和Miseq技术检测杭白菊根际土壤中细菌群落结构的特性。结果 1、研究发现蚕沙发酵后微生物多样性增加,菌群结构发生了明显的变化,变形菌从蚕沙中的22.05%增加到了53.09%,成为了绝对优势菌群,同时发酵还促进了拟杆菌、疣微菌的生长,削弱了蚕沙中原有的厚壁菌、放线菌的优势,尤其是放线菌,蚕沙中的百分含量为22.63%,而蚕沙发酵肥中只有1.16%。通过对属的分析结果发现,未发酵的蚕沙中的益生菌以生防菌为主,发酵后的蚕沙肥除了生防菌Bacillus与Burkhioldera外,还有大量的固氮菌Rhizobiumr、Devosia和Nitratireducto以及对化感物质有降解作用的细菌Ochrobactrum。2、连作组的杭白菊存活率为80%,其它处理组均达到了 100%,有效提高了连作杭白菊的存活率。与此同时,连作组的产量为0.29kg/m2,也是所有处理组中的最低值,而轮作组产量最高,达到0.61kg/m2,其次是蚕沙发酵肥(0.59kg/m2),石灰组(0.51kg/m2),市售菌肥组(0.50kg/m2)和蚕沙未发酵组(0.49kg/m2)。综合存活率和产量来看,轮作依旧是实践中解决杭白菊连作障碍最有效的办法。但在土地有限,轮作难以实行的情况下,我们的自制的蚕沙发酵肥无疑是一个好的解决办法,能显著提高连作杭白菊的存活率和产量。目前的研究表明,连作会使土壤酸化,分析土壤理化性质发现,5个处理组土壤pH、酸性磷酸酶和脲酶活性均比连作组高,明显改善了因连作而导致的土壤酸化现象,说明杭白菊之所以发生连作障碍,与土壤理化性质不无关系,而相反,在实践中如果有目的性地改变土壤理化性质如提高pH、酶活,则可能会缓解连作障碍。但是,从石灰组的结果来看,仅仅通过添加石灰来提高土壤pH虽然也有效,但不如蚕沙发酵肥的效果好,说明改变pH不是最有效的办法。3、分析了连作、轮作、蚕沙发酵肥、市售菌肥4个处理组杭白菊根、茎、叶内生菌,T-RFLP结果显示HaeⅢ内切酶能产生更多的TRFs数,比Hinfl酶更适合用来分析杭白菊内生菌多样性。有机肥和菌肥处理组的内生菌Simpson指数与轮作组相近,均高于连作,说明土壤外源微生物的添加导致植物内生菌多样性提高。实验共筛选出18种优势菌属,包括3种厚壁菌、4种放线菌和11种变形菌,其中节杆菌属、链霉菌属、黄杆菌属和分支杆菌属等优势菌属均在轮作、蚕沙发酵肥、市售菌肥处理组中检测到,而连作组中缺乏,说明添加外源微生物与轮作处理对杭白菊的内生菌群的影响基本类似,同时也说明这些菌的增加可能会通过影响连作白术的生长来缓解连作障碍。此外,比较不同器官中的内生菌的多样性及优势菌数量发现,根中最高,茎次之,叶中最少,这与内生菌侵入植株方式有关。4、通过末端标记限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)分析了连作、轮作、蚕沙发酵肥3个处理组对连作杭白菊根际土壤细菌群落的影响。结果显示,连作组、轮作组和施肥组的Hae Ⅲ酶切后Shannon指数分别为:3.08、3.24、3.24,HinfⅠ酶切后Shannon指数分别为3.31、3.60、3.57,可见连作组的细菌多样性明显低于轮作组和施肥组,说明连作使杭白菊根际细菌生物多样性下降,而轮作和施肥则可显著提高根际细菌多样性水平。对优势菌属进行比对分析发现,不同处理组间有较大的差异。连作组的9种优势菌属中梭酸属(Clostridium)、植原体属(Phytoplasma)、黄单胞菌属(Xanthomonas)为致病菌属;施肥组的8种优势菌属中梭酸属和黄单胞菌属为致病菌属,另6种为有益菌;轮作组的8种优势属中仅有梭酸属为致病属,其余7种均为有益菌。由此推测,施肥和轮作处理均会改变根际细菌群落结构,主要体现在减少致病菌的伤害。此外,在施肥组中还发现了被誉为生防菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)5、利用Miseq测序技术检测杭白菊根际细菌群落结构。Shannon指数和ACE指数均显示5个处理组增加了连作土壤中细菌多样性。主成分析结果显示,石灰组与轮作组中的细菌群落结构更相似,而蚕沙发酵肥组、蚕沙不发酵肥组以及市售菌肥组的细菌结构相似。优势菌群分析发现,它们中的变形菌、酸杆菌、放线菌、TM7、厚壁菌门、浮霉菌门、拟杆菌门、疣微菌门的总含量就占了土壤细菌中的90%。与连作组相比,5个处理组增加了酸杆菌门(Acidobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的优势性,蚕沙发酵肥与蚕沙不发酵肥的放线菌、浮霉菌门(Planctomycetes)百分含量最高与其它组有显著性差异。优势属的分析显示,5个处理组增加了有益菌的含量如:生防菌Bacillus与Burkholderia:固氮菌属Bradyrhizobium和Devosia以及对芳香烃类化合物有降解作用的Chitinophaga和Sphingobium。结论 轮作、蚕沙发酵肥、蚕沙不发酵肥、市售菌肥以及石灰5个处理均起到了防治杭白菊连作障碍的作用,提高了连作杭白菊的存活率、产量,杭白菊植株长的更旺盛,并提高了根际土壤pH以及酸性磷酸酶和脲酶的活性,增加了根际细菌多样性,促进了有益菌如生防菌Bacillus与Burkholderia:固氮菌属Bradyrhizobium和Devosia以及对芳香烃类化合物有降解作用的Chitinophaga和Sphingnobiuw的生长繁殖。