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抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一类由12-50个氨基酸组成的富含阳离子的小分子蛋白,具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性。抗菌肽广泛存在于自然界生物中,目前发现的已经超过1500种。本实验室在构建雄性大海马孵化袋的cDNA文库时,发现了1条新的基因序列。该基因的ORF有168bp,与数据库中大西洋庸鲽pleurocidin-like抗菌肽Hb26的编码基因和美洲拟鲽pleurocidin-like抗菌肽PLE3的编码基因有80％以上的同源性。新基因命名为hkplp(Hippocampus kuda Bleeker pleurocidin-like peptide),编码55个氨基酸的多肽,由信号肽、前体肽和成熟肽组成。其中成熟肽含有24个氨基酸,富含碱性氨基酸,推测具有潜在的抗菌活性,命名为HKPLP。由于HKPLP序列较短,并且可能杀伤宿主细胞,基因工程重组表达和纯化存在困难,因此我们使用了更适于短肽的固相化学合成方法,成功合成并纯化出具有活性的HKPLP。
固相化学合成HKPLP的流程如下：按照HKPLP的一级序列(FLGLIFHGLVHAGKLIHGLIHRNR-NH2),从N端到C端将含有保护基团Fmoc的氨基酸逐一连接到Resin Rink树脂上。具体步骤是,脱去氨基酸上的Fmoc保护基团,冲洗树脂,活化氨基酸中的羧基,然后连接氨基和羧基形成肽键。使用的耦连试剂为HOBt/HBTU/DIPEA(1∶1∶0.9),反应2小时。经过反复的耦合、脱保护、清洗过程,将24个氨基酸连接好,最后使用裂解试剂R将合成好的多肽从树脂上切割下来,脱去氨基酸侧链的保护,离心得到粗肽。用高效液相色谱仪梯度洗脱分离粗肽,流速1mL/min,检测波长215nm,得到的多肽纯度达到98％以上。飞行时间质谱MALDI-TOF MS检测,分子量为2716.279 Da,与HKPLP理论分子量2716 Da一致,证明合成正确。抑菌谱和最小抑菌浓度实验表明,在较低浓度下(MIC1.5-7.5μM),HKPLP对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有明显的抑菌活性,在较高浓度下(96-384μM),HKPLP也可以抑制一些真菌的活性。与很多抗菌肽类似,海马抗菌肽HKPLP对热稳定。在80℃以下孵育30分钟,HKPLP的活性不受影响。在100℃煮沸30分钟,HKPLP的活性下降约20％。酸性pH对抗菌肽的抑菌活性几乎没什么影响,但碱性pH却对其活性有一定的抑制作用。圆二色谱预测分析HKPLP结构,在190-260nm波长范围,吸收峰成V字型,在198nm处达到最大值。计算各种结构含量,HKPLP含有48.1％的antiparallel和13.4％的parallel sheets,提示我们HKPLP的二级结构可能以β折叠为主。在上述理化性质和结构研究的基础上,我们完成了中等规模海马抗菌肽的合成并试生产了批量产品,通过了生物安全性测定,评定了HKPLP作为饲料添加剂在虾和鸡饲养中的使用效果,制定了产品标准,产品名利生肽,产品号QB/440000659816-2009。在化学合成平台建设和完善期间,我们还成功合成了其它多肽,包括胸腺五肽、胸腺肽α1、芋螺毒素Ts-3、载脂蛋白模拟肽等。以上结果证明固相化学法是一种高效的获得大量蛋白和多肽的手段,可以广泛应用于抗菌肽和其它活性多肽的合成与制备。综上,从雄性海马孵化袋cDNA文库中发现的多肽HKPLP具有显著的抗菌活性和较好的热稳定性,可作为饲料添加剂广泛使用,还可考虑进一步应用到日化产品及保健品中。本研究为海马抗菌肽HKPLP大规模的应用提供了理论和生产依据,并为其它活性多肽的深入研究和应用奠定了基础。