柑橘黄龙病菌在九里香中消长变化及原噬菌体序列分析

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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing)是柑橘生产上的毁灭性病害,最早在我国广东省潮汕地区发现,至今已有100多年的历史。它几乎为害柑橘的所有栽培品种,包括橙类、橘类、柚类等柑橘属的植物。目前,人们普遍认为黄龙病是由原核生物、薄壁菌门、a-变型菌纲(Proteobacteriacea)的候选韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter spp)所引起,包括3个种:亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus);非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲种(Candidatus Liberibacter americanus),迄今为止,我国仅检测到亚洲种。该病害的远距离传播主要依靠带病苗木和接穗的调运,田间近距离传播主要依靠柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)。   九里香(Murraya paniculata)是柑橘木虱最喜爱的寄主植物,也是种植面积较大的常绿植物,许多城乡常规种植的观赏植物,有些果园甚至用它作为防护带植物来种植。一些学者希望从九里香中寻找出抗黄龙病的基因并希望转移到柑橘品种中,但未获得成功。九里香是否是黄龙病菌的寄主?其病菌与其他柑橘品种上的是否存在差异?黄龙病菌在九里香植株体内的全年的消长变化规律如何?这些都是非常重要和有必要弄清楚的工作。   目前,人们普遍认为地理环境因素是造成”Candidatus Liberibacter asiaticus”种群多样性的重要原因,但是基于保守序列的多样性分析表明,不能把“Ca.L.asiaticus”按照地域区分开来。随着“Ca.L.asiaticus”全基因组序列测序的完成,使寻找新的基因用于“Ca.L.asiaticus”多样性的研究成为了可能。原噬菌体序列广泛存在于细菌基因组中,并在大片段的基因转移和细菌致病性等方面起着重要的作用。初步分析发现,在“Ca.L.asiaticus”中存在原噬菌体基因序列,本研究选定一原噬菌体末端酶大亚基片段CLIBASIA_05610,对广东和云南的“Ca.L.asiaticus”种群多样性进行了初步的研究。   主要研究结果如下:   1.通过常规PCR技术从九里香中扩增得到了16S rRNA基因、外膜蛋白基因、内转录间隔区序列,对这些片段进行克隆和测序比对,发现其与柑橘黄龙病菌“Ca.L.asiaticus”的同源性均达到98%以上。   2、构建TaqMan实时荧光PCR检测“Ca.L.asiaticus”的体系,对来自广州的5个九里香样品中病原含量进行全年动态监测,结果表明“Ca.L.asiaticus”不能在九里香体内的存在两个月以上。   3、通过常规PCR检测发现,在广东120个感染“Ca.L.asiaticus”的柑橘样品中,有19个样品检测到了原噬菌体基因序列(CLIBASIA_05610),在云南39个感染“Ca.L.asiaticus”的柑橘样品中,有38个样品检测到了原噬菌体基因序列(CLIBASIA_05610),原噬菌体在两地的出现频率不同说明广东和云南的“Ca.L.asiaticus”种群存在差异。   4、对来自广东和云南的原噬菌体基因CLIBASIA_05610进行克隆和测序分析发现,两地的原噬菌体基因序列是高度同源的,这说明两地的原噬菌体序列有着相同的起源。
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