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近年来食品安全事件频发,其中由微生物引起的食品腐败和食源性疾病占很大一部分比例。化学防腐剂的添加可有效抑制食品中的腐败微生物,但人工防腐剂易在人体内蓄积,长期摄入对人体具有潜在危害性,急需发现新的天然食品防腐剂来作为替代品。而由乳酸菌产生的细菌素对人体无危害作用,可被人体胃肠道内蛋白酶降解消化,具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。片球菌素PA-1即是由戊糖片球菌产生的一种细菌素,相比于Nisin在pH6.0时就有90%以上的活性丧失的特点,其性质更稳定,抑菌谱较广,对单增李斯特菌的抑制作用尤为明显,在食品防腐保鲜领域中具有更广泛的应用前景。本研究以实验室前期从内蒙古干酪中筛选出的能产生片球菌素PA-1的戊糖片球菌C-2-1菌株为基础,对该菌株进行了全基因组测序研究,并对菌株进行安全性评价。对戊糖片球菌C-2-1产片球菌素PA-1进行了固定化细胞发酵条件优化,以及片球菌素pedA基因的原核表达与蛋白纯化,并进一步研究了信号肽在片球菌素PA-1可溶性表达中的作用机制。具体研究方法如下:(1)戊糖片球菌C-2-1全基因组测序及分析。利用全基因组测序技术对戊糖片球菌C-2-1基因组进行研究,预测了其基因组的组分并注释相应的功能基因,并进一步探究了戊糖片球菌C-2-1的代谢途径。戊糖片球菌C-2-1基因组总长度为1643106bp,共含有1946个基因。GC含量为37.87%,共84个Scaffolds,93个Contigs;COG蛋白功能注释后发现共有1371个基因成功获得COG功能注释。最多的功能归类为碳水化合物转运和新陈代谢,共有144个基因,占10.5%。参与翻译,核糖体结构和生物合成的基因有140个,占10.07%;1007个基因在GO数据库中成功得到了注释,包含了生物学过程(20个分支)、细胞组分(12个分支)和分子功能(11个分支)三大亚类。生物学过程类中细胞过程和代谢过程最为活跃,细胞组分类别中涉及基因最多的为细胞和细胞部位,分子功能类别中结合和催化活性起着重要作用。KEGG富集分析显示戊糖片球菌C-2-1的基因中能对应到KEGG pathway的有1102个基因,共存在于126条代谢通路中,其中参与次级代谢产物的生物合成的基因有113个。antiSMASH软件预测戊糖片球菌C-2-1基因组得到13个基因簇,预测到了单一的细菌素合成基因簇,位于Cluster 4基因簇,在戊糖片球菌C-2-1基因组上的位置信息为scaffold1,起始基因位点为405542-411580。还预测到5个糖类合成基因簇,2个脂肪酸合成基因簇,5个未知基因簇。最后运用ARDB和VFDB数据库对菌株的安全性进行了初步评价,ARDB抗生素抗性基因数据库和VFDB致病菌毒力因子数据库对比后发现,戊糖片球菌C-2-1不含有抗生素抗性基因,且不含有侵袭性毒力因子,可基本断定戊糖片球菌C-2-1的菌株安全性良好。戊糖片球菌C-2-1基因组信息的获得,为以后的戊糖片球菌C-2-1产细菌素的相关研究提供了丰富的理论基础。(2)片球菌素PA-1的固定化细胞发酵生产条件优化。以海藻酸钙为原材料,采用包埋法对戊糖片球菌C-2-1细胞进行固定化发酵培养,首先利用单因素实验确定了固定化细胞发酵时间和温度分别为42h和30℃,在此培养条件下,利用响应面分析法确定了固定化细胞发酵生产片球菌素的各因素的最佳值为:氯化钙浓度2.41%,海藻酸钠浓度1.68%,固定化颗粒接种量11.68%,菌体包埋量0.066。在此预测条件下经实际测定后的抑菌活性与预测值接近,表明本实验获得的模型可用于戊糖片球菌C-2-1固定化细胞产片球菌素能力的预测。经固定化细胞制备和发酵过程中各因素优化后,戊糖片球菌C-2-1固定化细胞片球菌素的抑菌活性提高了36.9%。(3)片球菌素pedA基因的原核表达与蛋白纯化。以戊糖片球菌C-2-1菌株的总DNA为模板,设计引物扩增片球菌素PA-1成熟肽的结构基因pedA,构建了pET28a-pedA重组质粒,转入大肠杆菌后经诱导表达、Ni-NTA柱纯化、Tricine-SDS-PAGE电泳分析后,获得了分子量在7.8kD左右的可溶性重组蛋白,与ProtParam蛋白分析工具的分子量预测值相符。经单核细胞增生李斯特菌抑菌检测显示,重组片球菌素具有明显的抑菌活性。本实验成功表达的可溶性重组片球菌素PA-1未加入分子伴侣及融合蛋白,使得重组PA-1的提取、纯化更简单,为以后片球菌素PA-1在食品防腐保鲜领域的应用奠定了很好的基础。运用生物信息学手段,进一步分析了重组片球菌素PA-1的结构信息,其结构中含有的α-螺旋结构可能与本实验重组蛋白在大肠杆菌体内可溶性表达相关。(4)信号肽在片球菌素PA-1可溶性表达中的作用机制研究。实验首先运用生物信息学方法进行比较分析两种PA-1的理化性质及二级结构,发现不含信号肽的PA-1细菌素不含α-螺旋结构,而含有信号肽的片球菌素PA-1的α-螺旋结构占23.53%,重组蛋白疏水性提高。后以戊糖片球菌C-2-1菌株的总DNA为模板,设计两种引物扩增片球菌素PA-1成熟肽的结构基因pedA的全长和不含有信号肽的片球菌素PA-1的结构基因,构建两种pET28a-pedA重组质粒,在E.coli细胞内表达两种重组片球菌素PA-1,经包涵体复性和纯化后获得了具有抑菌活性的两种重组片球菌素PA-1。可基本断定含有信号肽的PA-1蛋白含有的疏水核心信号肽可能促进了重组蛋白的分泌,从而获得了较稳定的重组蛋白,使提取和纯化更为简单。