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轮状病毒是导致全球婴幼儿腹泻的单一主因,全球因轮状病毒每年导致的死亡病例高达80万。目前轮状病毒感染没有有效的治疗药物,现有的疫苗在不同地区保护效果差距较大,价格昂贵且存在发生潜在感染的安全隐患,因此更加安全可靠、高效廉价疫苗的研发就成为当务之急。有效的动物模型是疫苗研发过程十分重要的环节和保障,也是研究病毒感染进程和致病机理的主要手段。轮状病毒的感染动物模型主要包括无菌猪、猴,小鼠等,由于这些模型在亲缘关系、实验周期、解剖学特性等方面的局限性,导致RV感染与致病的机制研究受到较大限制。树嗣因其体型较小,繁殖快,饲养成本低和新陈代谢及解剖学特性与人类接近而受到的重视。近年来,有许多研究表明树鼢可以被RV感染,成为研究RV感染的潜在动物模型。本研究建立了轮状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,以轮状病毒VP6基因为靶基因,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,扩增目的片段,将目的片段克隆于PCDNA3.1+载体上,体外转录获得RNA,系列稀释后为标准品,建立TaqMan探针荧光定量实时PCR检测方法并对该方法进行验证。设计实验找到最优条件下的引物浓度(250nM)、探针浓度(300nM)；通过对引起腹泻的人柯萨奇病毒、呼肠孤病毒等进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有很好的特异性。该方法的最低检测量为5000copies/mL。对该方法进行重复性实验,发现变异系数CV均小于1%,重复性好。本实验初步建立了人G1型轮状病毒TaqMan探针荧光实时PCR检测方法,为G1型轮状病毒的诊断、检测和分子流行病学研究提供了一种新的方法。本实验采用本实验采用了胰酶、胶原酶法、胶原酶(xⅠ型)和中性蛋白酶(Ⅰ型)混合使用三种方法,最终确定了胶原酶(xⅠ型)和中性蛋白酶(Ⅰ型)混合使用获取的小肠上皮细胞较稳定,采用相位差消化法和相位差贴壁法来获取纯净的树铜原代小肠上皮细胞,同时采用人角蛋白18抗体对获取的小肠上皮细胞进行鉴定,鉴定结果阳性,说明获取的细胞为树鼩原代小肠上皮细胞。用RV感染的树鼩原代小肠上皮细胞,通过定性,荧光定量PCR,蛋白、细胞水平检测后,均证实树鼩原代小肠上皮细胞对RV具有一定的感染性。采用梯度稀释、荧光定量PCR等方法检测病毒的最适感染复数及在细胞内的增殖特性。将轮状病毒分别以MOI=1,2,3,4接种于树鼩小肠上皮细胞,经测定发现MOI=3时,病毒的载量最大。采用梯度稀释法和荧光定量PCR法分别测定病毒在增殖过程中滴度和载量的变化,并绘制病毒增殖曲线。发现病毒在第一天感染时有较低的滴度和载量,2-3天呈现一个指数增长的趋势,并在第3天达到一个平台期并随着时间的延长呈现一个降低的趋势。尽管总体感染率较低,但结果显示树鼩作为潜在的RV感染动物模型,用于后续研究。综上所述,本研究成功构建了轮状病毒体外感染树鼩动物模型,该模型的建立对于轮状病毒疫苗的研发、抗体治疗有效性评估以及病毒感染机理的研究具有重要的意义。