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研究背景临床上因各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形外科面对的主要问题之一。软组织缺损所致的凹陷畸形可能影响患者的容貌甚至功能活动,并进而影响其心理健康和生活质量。缺损所致的凹陷畸形必须采用组织或材料充填来修复,目前临床上常用的方法主要有自体组织的外科移植和注射移植、人工材料植入和注射充填等,但这些方法均不同程度地存在一些问题。如自体组织移植包括自体脂肪、软骨、筋膜等,都需要从患者自身切取,会造成新的创伤与瘢痕,且植入组织不稳定,脂肪易液化吸收,软骨可能变形甚至被吸收,筋膜易发生纤维化且质地较软,在不同程度上给患者增加痛苦并可能造成继发畸形,因此自体组织移植都存在一定的局限性。人工充填材料植入可能并发感染、排异反应、对组织细胞的刺激以及植入体所引起的纤维囊和炎性肉芽组织增生等,这些缺点使之不尽人意。而组织工程修复软组织缺损,目前还处于研究阶段,无论是基础研究还是临床应用都存在诸多问题,短期内难有突破性进展。因此研究开发生物相容性好、来源丰富、安全有效的充填材料,一直是整形外科的研究热点。近年来脱细胞基质材料的研究进展为组织充填材料的研发指明了前景。脱细胞基质材料因其结构与人体组织相似,与细胞亲和性强,能为细胞分化、增殖、生长及功能发挥提供近似体内组织发生发育的细胞外基质(ECM)支架条件,加之其来源丰富,故逐渐被应用到再生医学领域。采用各种脱细胞技术处理的异种基质材料,如膀胱、输尿管、骨组织、心瓣膜、硬脑膜以及脱细胞真皮等,经动物实验研究和临床试验证实具有良好的组织相容性。临床上,脱细胞真皮材料有多种产品已被批准应用,但脱细胞真皮材料因其质地、厚度和体积的限制,针对特定的组织充填如隆鼻、隆下颌等仍不能完全满足要求,临床应用有一定的局限性。目前在整形外科领域,还鲜有关于脱细胞肌腱的研究报告,动物组织肌腱组成主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原,其组成与软骨相似,且肌腱组织更容易成形并具有一定的厚度,因此可成为理想的材料来源,脱细胞肌腱相对于脱细胞真皮的优点,使其在软组织缺损的充填修复方面具有广阔的应用潜力。本研究前期与再生型医用植入器械国家工程实验室(广东冠昊生物科技股份有限公司承担)合作,完成了异种脱细胞肌腱材料的制作、生物学性能检测和生物相容性初步研究。一、采用同种环氧化物交联处理技术,应用组织固定、去抗原等系列专利技术,将猪的肌腱制备成异种脱细胞肌腱。该脱细胞肌腱材料保留了肌腱固有的三维结构及良好的生物力学特性。且此种环氧化物可与蛋白质分子形成稳定的交联键,大大提高材料的稳定性,无残留毒性,使被处理的异种材料不仅稳定性好,不引起免疫排异反应,还能诱导机体组织向其中生长,并和机体组织融为一体。二、经过对制备的异种脱细胞肌腱材料的形态学(包括光镜及扫描电镜)观察、力学性能检测、化学稳定性进行检测,结果表明：(1)异种脱细胞肌腱材料为纤维条束样结构,脱细胞完全,未见细胞成份。(2)材料力学性能优良,符合医用生物材料的标准规定。(3)材料组成单一,具有良好的化学稳定性,无环氧化物及重金属残留。三、将异种脱细胞肌腱埋植于实验犬背部脊柱两侧皮下软组织内,未出现感染、坏死等异常反应。本研究拟在前期研究基础上,将猪脱细胞肌腱经生物工艺加工成“L”形鼻充填材料,对其微观结构进行研究观察；通过体外急性毒性试验、致敏试验、皮内刺激实验、细胞毒性试验和动物(犬)鼻部植入实验,研究该材料的生物相容性和生物安全性；通过临床试验,观察验证人体鼻部植入异种脱细胞肌腱材料后的生物相容性和临床实用性。通过上述研究观察为研发异种脱细胞肌腱鼻充填材料提供依据。研究方法一、异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料体外生物相容性研究参照医疗器械生物学评价标准和要求,采用标准的毒理学方法进行急性毒性试验、致敏试验、皮内刺激实验、细胞毒性试验,对制备的异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料进行系统的体外生物相容性及生物安全性评价。异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料扫描电镜检测(SEM)：取制备的异种脱细胞肌腱充填材料的切片,2.5%(V/V)戊二醛4℃固定24h,经30%-100%梯度乙醇脱水、醋酸异戊酯浸泡30min、等电点干燥。干燥后的样品表面喷铂金,SEM观察异种脱细胞肌腱鼻充填材料的微观结构。二、异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料体内生物相容性研究将XAT与硅胶分别植入24只狗(XAT组n=12只；硅胶组n=12只)鼻背骨膜下,于埋植后2周、1月、3月、12月(XAT组n=3只/时间点；硅胶组n=3只/时间点)取材行HE染色,采用半定量法比较两种材料的包膜反应、炎症反应及间质反应程度来评价XAT体内生物相容性。异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料免疫组化染色：通过免疫组化染色,研究XAT组织块周围基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达情况,对其在体内转归做初步研究。三、异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料临床试验征集志愿者,应用“L”形异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料和对照组用硅胶鼻假体,进行隆鼻临床试验,采用前瞻性、随机单盲、平行对照、非劣效临床研究,观察其临床效果。试证实异种脱细胞肌腱材料作为鼻部充填材料应用于鼻部修复整形中的安全性、有效性以及临床实用性。四、统计方法采用SPSS13.0统计软件包进行分析,数据以均数±标准差表示,XAT组及硅胶组间比较采用两独立样本非参数检验,数据以M (and range)表示,P值<0.05为有统计学意义。结果一、异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料体外生物相容性研究急性毒性实验：各组小鼠活动正常,72h小鼠无死亡,各组动物未见中毒症状或不良反应。致敏试验显示材料组和阴性对照组的皮肤反应指数均为0,无致敏性。皮内刺激实验观察显示,材料浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死,极轻微刺激。材料的细胞毒性结果示该材料的相对增殖度较高,细胞毒性分级在0-1级。异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料扫描电镜检测(SEM):XAT结构完整,胶原纤维纵行平行排列,未见断裂,纤维间存在大量裂隙,表面可见棉絮样附着物,未见细胞及其残核存留。横截面可见腱内膜分隔并包绕胶原纤维形成肌腱束,结构完整,内部未有细胞残留。二、异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料体内生物相容性研究埋植后2周,XAT组与硅胶组均有轻度炎症反应及轻微程度纤维组织包裹,炎症反应及包膜反应差异无统计学意义(P=0.841;P=0.638),XAT组间质反应轻度,较硅胶组明显,差异有统计学意义(P=0.007)。1月、3月,XAT组炎症反应逐渐减弱,包膜反应较硅胶组轻,间质反应增强,至12月XAT组炎症反应轻微,轻度纤维组织包裹,间质反应轻度,与较硅胶组差异均有统计学意义(P<0.005)。异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料免疫组化染色：XAT周围基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达情况： MMP-9在XAT周围表达阳性。三、异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料临床试验自2011年7月至12月,应用“L”形异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料和对照组用硅胶鼻假体,进行隆鼻临床试验,已完成9例。观察术后1周内有轻度创伤反应,伤口均一期愈合。随访最长半年观察无排斥反应、无感染及移植物外露。未发现假体有收缩或松弛情况,不移动,不变形,鼻部皮肤不变色,形态自然,未见透亮感。结论异种脱细胞肌腱充填材料脱细胞完全,结构完整,理化性能符合国家医用生物材料的标准要求,体内、外实验证实其具有良好的生物相容性和生物安全性,能满足作为鼻充填材料应用于鼻部修复整形中的生物安全性要求。临床试验结果初步证实“L”形异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料组织相容性好,无排异性。“L”形异种脱细胞肌腱(XAT)鼻充填材料有望成为一种良好的隆鼻材料应用于临床。