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miRNA(microRNA)是一类内源性非编码小RNA分子,长度约为20~25个核苷酸。miRNA通过与靶基因非翻译区结合调控靶基因的表达,参与调控机体多种生理过程。本实验室前期研究中在家蚕感染质型多角体病毒(BmCPV)72h及96h后对中肠组织进行Solexa测序,发现数个差异表达的小RNA,且其中有新发现的mi RNA。本实验选择其中一条新发现的miRNA Novel-31*作为实验研究对象,采用生物信息学分析预测其靶基因,通过构建miRNA及靶基因慢病毒表达载体,转染293T细胞,验证Novel-31*对靶基因表达的调控作用。同时采用化学法合成Novel-31*mimics,在家蚕细胞BmN及蚕体水平验证Novel-31*对靶基因的表达调控作用。得到如下实验结果:1、家蚕感染BmCPV后Novel-31*及其靶基因表达发生变化利用RNAhybrid及NCBI Blast等生物信息学在线软件预测,发现溶血素基因是miRNA Novel-31*的靶基因之一。通过primer 5.0设计溶血素基因qRT-PCR引物及Novel-31*stem-loop qRT-PCR引物,家蚕感染BmCPV后,不同时间点取家蚕血淋巴及中肠组织,定量检测Novel-31*及溶血素基因表达变化。结果发现,家蚕感染BmCPV后,Novel-31*在血淋巴中的表达量明显升高,中肠组织中在感染96h后表达量上调;家蚕感染BmCPV后,溶血素基因在血淋巴中表达量明显升高,在中肠组织中表达基本无差异。2、Novel-31*对溶血素基因表达具有正调控作用(1)设计Novel-31*及溶血素5′UTR引物,扩增相应序列,分别构建表达Novel-31*和靶基因5′UTR+GST的慢病毒表达载体pLKO.3G-miR-N31*及pLNHX-UTR-GST。先将重组质粒pLNHX-UTR-GST转染293T细胞,72h后获得稳定表达5′UTR+GST基因序列的293T细胞,然后将重组质粒pLKO.3G-miR-N31*转染该293T细胞,24h及48h后收集细胞,以新霉素基因neo为内参,qRT-PCR定量检测溶血素基因及GST标签基因的表达变化。结果发现,Novel-31*能够上调GST标签的表达,说明Novel-31*能够与溶血素基因5′UTR序列结合,且正调控溶血素基因的表达。(2)为进一步验证Novel-31*对家蚕溶血素基因的调控作用,采用化学法人工合成了Novel-31*mimics。将Novel-31*mimics转染家蚕BmN细胞,检测溶血素基因的表达变化。结果表明,家蚕BmN细胞转染Novel-31*mimics 24h后,溶血素基因表达无明显差异,48h后溶血素基因呈现显著的上调表达,至72小时该基因仍然呈上调表达,但上调表达水平有所下降,可能是由于人工合成的mimics发生降解,NC组与空白对照组,溶血素基因表达均无明显差异。该结果直接证明了Novel-31*对溶血素基因的表达起正调控作用。(3)采用体腔注射方法,分别将不同浓度Novel-31*mimics注射家蚕体内,不同时间点取家蚕血淋巴及中肠组织,定量检测溶血素基因的表达变化。结果发现,注射不同浓度Novel-31*mimics,溶血素基因在血淋巴和中肠组织中均明显上调表达,注射DEPC水和Negative control组,溶血素基因表达量无明显差异。进一步证明溶血素基因是Novel-31*靶基因之一,且Novel-31*正调控靶基因的表达。本实验对Novel-31*及其靶基因溶血素基因的研究结果,为家蚕乃至其他昆虫miRNA抵御病毒感染的免疫机制提供了新的实验依据。