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胚胎干细胞(embryonic stem cells ESCs)是具有无限自我更新能力和多向分化潜能的细胞,其既可通过对称分裂保持不分化状态,也可分化形成如淋巴细胞、造血细胞、神经细胞等多种细胞。ES细胞自我更新必定要依赖于多个信号通路的协同作用来维持,对其调控机制的研究不仅对了解胚胎发育的分子机制具有重要意义,也能为胚胎干细胞的临床应用提供理论基础。然而目前对于其相关信号通路及调控机制尚不完全清楚,因此探索和研究新的信号分子对于进一步了解胚胎干细胞自我更新调控机制及分化机理非常必要。肿瘤干细胞(cancer stem cells CSCs)是肿瘤细胞中存在的一群与胚胎干细胞生物学特性极为相似的细胞,近来研究结果显示,胚胎干细胞中的自我更新标志分子Nanog、Oct-4等在肿瘤干细胞中也异常表达,并参与其自我更新的调控,提示两者可能存在相同的干性调控通路。癌基因Bmi-1在多种肿瘤细胞中高表达,并在维持CSCs及造血、神经等成体干细胞的自我更新中发挥作用。胚胎干细胞中也检测到该基因的高表达,那么Bmi-1是否也同样参与了胚胎干细胞中多能性的维持则是我们感兴趣的问题。为了研究Bmi-1分子在胚胎干细胞中的作用,本实验首先构建了Bmi-1鼠源真核表达载体,转染胚胎干细胞系CCE并获得稳定转染株,最后通过检测稳定转染株与对照细胞在增殖、自我更新和分化等方面差异探讨Bmi-1分子对胚胎干细胞自我更新维持的作用。研究内容和结果主要包括以下几个方面:1. Bmi-1过表达载体的构建:Bmi-1mRNA逆转录产物经mBmiCDSF/mBmiCDSR引物扩增后,得到含有EcoRI和SalI酶切位点的Bmi-1全长编码序列,将该序列克隆至pCI-GFP载体中,得到N端融合表达EGFP荧光蛋白的pCI-GFP-bmi1真核表达载体。2.表达载体pCI-GFP-bmi1在胚胎干细胞系CCE中的表达:将该表达载体瞬时转染CCE细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达。转染pCI-GFP-bmi1细胞中,荧光蛋白表达于细胞核内;而转染对照质粒pCI-GFP的细胞中,荧光蛋白均匀分布。3.稳定转染株的筛选和鉴定:将转染细胞于筛选培养液(含400μg/ml G418的ESC培养液)培养12天后,筛选得到稳定转染株,分别为过表达Bmi-1的pCGB/CCE和对照株pCG/CCE。DAPI染色后于共聚焦显微镜下观察可见,pCGB/CCE细胞中EGFP-bmi1融合蛋白特异性表达于细胞核中,与DAPI染色的细胞核重叠,并呈颗粒状分布。半定量RT-PCR和免疫印迹结果显示EGFP-bmi1融合蛋白正确表达。4. Bmi-1对ES细胞增殖的影响:细胞增殖实验结果显示,与对照株pCG/CCE相比,在同等培养条件下,pCGB/CCE细胞增殖能力明显增强。在LIF+培养条件下尤其显著,在第5天可见细胞增殖数目的明显差异。说明过表达Bmi-1有助于促进ES细胞增殖。5. Bmi-1对ES细胞自我更新能力的影响:克隆形成实验结果显示,在LIF(+10ng/ml)和LIF-1(1ng/ml)培养条件下,pCG/CCE细胞形成的AP染色阳性克隆率分别为45.7%和26.7%,与之相比,过表达Bmi-1的pCGB/CCE细胞AP染色阳性克隆率则明显增高,分别为71.4%和62%。对细胞中干性分子检测的结果显示:与对照株pCG/CCE相比,过表达Bmi-1的pCGB/CCE细胞中,干性分子nanog的mRNA表达水平明显上调,oct-4和sox2分子的表达也略有上调。而c-myc的mRNA表达水平则显著降低。随后对Nanog和c-Myc行蛋白印迹结果显示与分子水平表达一致。说明Bmi-1可促进ES细胞自我更新。6. Bmi-1对ES细胞分化的影响:无LIF筛选培养液中单层培养及诱导形成EB分化后,对细胞中的干性分子和分化标志分子进行检测。半定量RT-PCR结果显示,与对照相比,过表达Bmi-1的细胞中,干性分子如Nanog等表达较高而分化标志分子如GATA6、GATA4表达则较低。说明Bmi-1分子的过表达会阻碍ES细胞分化,特别是原始内胚层方向。综上所述,本研究分别从增殖、自我更新和分化三个方面探讨了过表达癌基因Bmi-1对胚胎干细胞的影响。研究结果显示过表达Bmi-1有助于促进ES细胞的自我更新及增殖能力,并阻碍其分化。研究结果表明Bmi-1参与了对胚胎干细胞自我更新及分化的调控,为进一步研究其调控机制奠定了基础,并为深入了解ES细胞发育机制提供了新的靶点和线索。