论文部分内容阅读
质膜Ca2+-ATPase(plasnlamembraneCa2+-ATPase，PMCA)在维持细胞内Ca2+的动态平衡中发挥着重要的作用。PMCA受多种因素的调控，如钙调蛋白、蛋白激酶、蛋白水解酶、酸性磷脂、多聚化和G蛋白等。本论文研究了神经节苷脂对猪血红细胞PMCA的调控及其机理。主要内容如下：
一.不同神经节苷脂对纯化猪血影膜PMCA的影响。
1.GM1(带一个唾液酸)能激活PMCA的活性，GD1b(带两个唾液酸)更强烈地激活PMCA的活性，而Asialo—GM1(不带唾液酸)对PMCA的活性没有影响。这表明神经节苷脂的唾液酸基团在调节PMCA的活性中发挥着重要的作用。
2.GM1、GM2、GM3这三种神经节苷脂含有相同的唾液酸，只是糖链的长度不同。实验结果表明，这三种神经节苷脂都能激活PMCA的活性，但效果略有不同。GM1在较低浓度时就已达到最大激活，GM3则在较高浓度时才达到最大激活，而GM2却是先激活，之后随浓度增加，激活程度反而下降。这表明神经节苷脂的糖链的长度也会影响PMCA的激活程度。
二.研究了神经节菅脂在PMCA的作用位点以及GM2对PMCA活性调节的双向性。
1.钙调蛋白与PMCA作用后能导致神经节苷脂激活PMCA的作用消失，但在此条件下，与其它神经节苷脂相比GM2却具有抑制作用。经Calpaln酶切去除PMCAC端钙调蛋白结合区(Calmodulinbindingdomain，CBD)后，GMl、GM2、GM3、GD1b对PMCA的激活作用也随之消失，这说明它们是与PMCA的CBD相结合才产生效应的，但此时Gbt2仍表现出抑制作用可能是与PMCA的另一位点—钙调蛋白样位点(Calmodulinlikesite，CLS)有关。
2.为了进一步阐明GM2抑制PMCA的结合位点，合成了PMCA构成CLS的相应序列(531-547)。这一合成的肽段并不改变神经节苷脂对PMCA的激活作用，但能竞争性消除GM2的抑制作用。这表明GM2的抑制作用是与PMCA的CLS区相互作用而实现的。
三.神经节苷脂对PMCA构象影响的初步研究。
1.神经节苷脂不改变丙烯酰胺对质膜Ca2+-ATPase内源荧光的淬灭常数。
2.神经节苷脂不改变ANS标记的质膜Ca2+-ATPase的发射光谱。
3.神经节苷脂对FITC标记的质膜Ca2+-ATPase的荧光淬灭常数无影响。
4.神经节苷脂的存在改变了MIANS2寸质膜Ca2+-ATPase的标记速率、MIANS-PMCA的荧光强度以及KI对MIANS-PMCA的淬灭能力。
四.研究了猪血影膜PMCA与脂筏的关系。
1.应用不同去污剂增溶血影膜来提取脂筏，PMCA在得到各组分中的分布截然不同，这与去污剂的去污能力有关。
2.从对实验结果的分析来看，PMCA在血影膜上可能主要是定位于脂筏区。
3.PMCA无论在脂筏区还是不在脂筏区都具有活性，说明PMCA的活性并不依赖于脂筏的微环境。