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MicroRNA (miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,主要通过与靶基因的3’UTR区结合使靶基因的mRNA翻译受到抑制或直接降解,从而调控发育、代谢和癌症等生物过程,是基因表达的重要调控因子。肝脏是脂肪酸合成的主要场所,在动物的脂质代谢过程中发挥着重要的作用。有研究发现miR-29c可以调控肝脏的纤维化,并且在抑制肝癌细胞转移等方面发挥重要作用。然而,在脂肪肝形成过程中miR-29c的表达与调控以及其功能尚不清楚。本实验对此进行较深入的研究,主要结果如下：1、填肥抑制了miR-29c在肝脏、胸肌和腹脂中的表达。本研究利用实时荧光定量技术测定了填肥朗德鹅与对照朗德鹅(常规饲养)胸肌、腹脂和肝脏中的miR-29c表达水平。结果显示,填肥显著抑制了这些与脂肪代谢相关组织中的miR-29c的表达,提示其在鹅肝脏脂肪代谢过程中扮演重要角色。2、miR-29c的靶基因预测与筛选。依据鸡鹅miR-29c种子序列的保守性,参考鸡的基因组序列,利用生物信息学软件miRDB、TargetScan、和Microcosm预测miR-29c的靶基因,两两取交集并参考已有文献筛选得到COL3A1、SGK1、INSIG1、DDX3X、 PPM1D、 TNFAIP3共6个靶基因。然后,通过对预测靶基因的定量验证发现COL3A1、SGK1、INSIG1三个靶基因在填饲后朗德鹅肝脏中的表达量显著上调,DDX3X、PPM1D、TNFAIP3的表达则未出现显著上调。依据miRNA通常与其靶基因表达量相反,我们推定COL3A1、SGK1和INSIG1最有可能是miR-29c靶基因。3、miR-29c的靶基因验证。首先,设计候选靶基因3’UTR序列特异性引物进行PCR扩增,经克隆测序获得扩增产物的序列。再利用pMIR-REPORT分别构建靶基因3’UTR靶序列区的表达载体,同时依据获得的鹅miR-29c成熟序列设计其模拟物用于靶向关系的验证。最后,通过在非肝细胞系CHO中建立的双荧光素酶系统验证鹅miR-29c的三个靶基因。结果表明COL3A1、SGK1和INSIG1为鹅miR-29c的靶基因。因此,miR-29c可能通过对这些基因的作用影响鹅肥肝的形成。4、在鹅原代肝细胞中miR-29c对靶基因表达的影响。通过设置miR-29c过表达组、抑制组以及相应的对照组,经肝细胞转染实验,以及靶基因COL3A1、SGK1、INSIG1的定量检测,发现COL3A1和INSIG1的表达在鹅原代肝细胞中受到miR-29c的调控,而SGK1的表达受miR-29c的调控可能为肝细胞中的其他因子所干扰。miR-29c对COL3A1和INSIG1表达的影响更容易在miR-29c表达受到抑制时发生。5、脂肪肝形成相关因子处理鹅肝细胞对miR-29c表达的影响。本研究利用不同浓度的葡萄糖、胰岛素、脂肪酸分别处理鹅肝细胞以检测对miR-29c表达的影响,结果显示100mmol/L葡萄糖和0.5mmol/L棕榈酸钾均可显著降低miR-29c的表达,但100 nmol/L胰岛素和0.5mmol/L油酸钠对miR-29c表达的影响甚少。说明高糖、高脂均可以诱导鹅肥肝中miR-29c的表达,进一步说明miR-29c的表达受鹅脂肪肝形成相关因子的调控。6、miR-29c介导葡萄糖对鹅肝细胞中靶基因INSIG1、COL3A1的调控。本实验对鹅原代肝细胞进行miR-29c抑制剂转染和葡萄糖处理,并定量检测靶基因COL3A1、INSIG1的表达情况。结果显示,100 mmol/L的葡萄糖能使INSIG1的表达显著上调,1niR-29c抑制剂能显著增强这种趋势,而100 mmol/L的葡萄糖能使C0L3A1的表达显著下调,但miR-29c抑制剂能显著抑制这种下调。这说明葡萄糖诱导的INSIG1和COL3A1的表达受到miR-29c的调控。7、miR-29c的上游转录因子预测及初步验证。首先设计miR-29c上游序列引物进行PCR扩增,经克隆测序获得上游序列。然后,通过Gene Regulation在线软件对鹅miR-29c的上游序列进行转录因子预测,筛选出转录因子RFX1。作为转录因子RFX1活性调节剂的维甲酸被用来处理鹅原代肝细胞。经检测,10μmol/L的维甲酸能使miR-29c的表达量显著上调。这初步说明转录因子RFX1可能介导了miR-29的表达调控。