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背景和目的:胃癌是全球常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第5位和第3位。我国是胃癌高发地区,全球每年新发胃癌半数以上在中国。近年来随着胃癌筛查工作大幅开展及对胃癌相关危险因素有效控制,其发病率和死亡率逐渐下降,但由于我国人口基数大以及人口老龄化严重,胃癌疾病负担依然严重,是癌症防治的重点。其早期病变局限时可通过手术和辅助疗法治愈,而一旦进展至晚期,治疗方法有限、预后较差。因此,明确胃癌的发生机制,实现早期诊断和基因靶向治疗意义重大。Polo样激酶1(Polo-like Kinase 1,PLK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可与多种底物相互作用,参与调节细胞有丝分裂、胞质分离、DNA损伤应答等过程。PLK1在多种人类恶性肿瘤和细胞系中高表达,并参与其发生发展,包括胃癌,且其表达上调与肿瘤的分期、淋巴结转移和扩散呈正相关。目前认为,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性非萎缩性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌这一演变过程的始动因素,然而其确切的致癌机制尚不明确。我们前期实验证实,Hp可诱导PTEN磷酸化失活,从而激活PI3K/Akt信号通路促进胃黏膜细胞存活,并参与胃黏膜癌变。另有研究表明,PLK1可磷酸化PTEN的Ser380/Thr382/383位点使之丧失磷酸酶活性,进而失去对下游信号的调控,导致细胞功能紊乱,肿瘤易感性增加。然而,PLK1与Hp感染的相关研究国内外暂无报道。Hp感染是否可诱导PLK1表达上调?PLK1上调能否调控PTEN/PI3K/Akt信号通路从而影响细胞生物学功能?本课题将针对这些问题进行研究,探索Hp致癌的可能机制。材料和方法:1.胃黏膜上皮细胞PLK1的表达及其与Hp感染的关系的体内外研究;(1)收集胃癌和癌远端组织,通过Western blot检测PLK1的表达;(2)收集慢性非萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生和胃癌组织,通过免疫组化检测不同病变阶段PLK1的表达,分析其与Hp感染的关系;(3)构建Hp感染动物模型,通过免疫组化检测PLK1的表达,分析其与Hp感染的关系;(4)构建Hp活菌与胃腺癌细胞株(MKN-28、HGC27、SGC-7901、AGS)体外共培养模型,通过Western blot检测不同分化程度的胃腺癌细胞株PLK1的表达,分析其与Hp感染的关系;2.体外Hp感染对PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响及PLK1在其中的作用;(1)构建Hp活菌与MKN-28细胞体外共培养模型,控制感染复数和感染时间,通过Western blot检测不同感染条件下PLK1的表达及PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达;(2)通过PLK1抑制剂BI2536预处理MKN-28细胞,再与Hp活菌构建体外共培养模型,通过Western blot检测干预后PLK1的表达及PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达;3.PLK1在Hp促胃黏膜上皮细胞生存中的作用(1)构建Hp活菌与MKN-28细胞体外共培养模型,通过CCK-8法检测细胞的存活率;(2)通过PLK1抑制剂BI2536预处理MKN-28细胞,再与Hp活菌构建体外共培养模型,通过CCK-8法检测细胞存活率。结果:1.胃黏膜上皮细胞PLK1的表达及其与Hp感染的关系的体内外研究;通过检测胃癌和癌远端组织PLK1的表达,发现癌组织PLK1表达显著高于癌远端;通过检测各病变阶段胃黏膜组织PLK1的表达,发现其在癌变进程中发挥着重要作用,呈逐渐增加的趋势。进一步分析发现在Hp阳性的肠上皮化生组织的表达明显高于Hp阴性组,而在慢性非萎缩性胃炎、异型增生和胃癌组织无明显差异;通过构建Hp感染蒙古沙鼠动物模型,亦发现Hp感染可导致胃黏膜组织PLK1表达升高,且与感染时间呈正相关;在体外进一步验证,发现Hp感染可诱导不同分化程度胃腺癌细胞株PLK1上调,高分化的MKN-28细胞PLK1基础表达最低,Hp诱导的PLK1上调最显著。以上体内外实验结果说明:Hp感染可上调胃黏膜上皮细胞中的PLK1表达,可能参与胃癌形成。2.体外Hp感染对PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响及PLK1在其中的作用;Hp活菌作用于MKN-28细胞2h,MOI=10即可诱导PLK1表达升高,并激活PTEN/PI3K/Akt信号通路,呈浓度依赖性;同样,Hp活菌以MOI=200作用于MKN-28细胞15min后亦可出现类似改变,呈时间依赖性;通过BI2536预处理后,PLK1及PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达无明显差异。以上结果说明:Hp感染在早期即可通过上调PLK1激活PTEN/PI3K/Akt信号通路。3.PLK1在Hp促胃黏膜上皮细胞生存中的作用通过CCK-8法检测细胞的存活率,发现Hp活菌按MOI=10、50、100、200作用MKN-28细胞15min后,各组细胞存活率随着时间的增长均开始逐渐升高,表现出时间依赖性,而且,在作用1h后,细胞的存活率亦随着Hp作用浓度升高而逐渐升高;通过BI2536预处理后则无显著差异,且对照组明显高于BI2536预处理组。以上结果说明:Hp促胃黏膜细胞存活的效应依赖于PLK1对PTEN/PI3K/Akt信号通路的激活。结论:1.Hp感染的早期即可上调PLK1的表达,诱导抑癌蛋白PTEN的Ser380/Thr382/383位点磷酸化失活,进而激活PI3K/Akt信号通路,促进胃黏膜上皮细胞增殖。2.PLK1表达上调是胃黏膜癌变过程中的重要分子事件,其可能通过激活PTEN/PI3K/Akt信号通路发挥作用,是胃癌化学预防和治疗的潜在分子靶标。