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产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)引起的仔猪大肠杆菌病在世界范围内广泛流行。该病可导致仔猪黄痢、白痢、水肿病及断奶腹泻等多种疾病,给猪场造成严重的经济损失。仔猪大肠杆菌病目前的防治方法包括服用抗生素和氧化锌药物,但抗生素导致大肠杆菌耐药性增加,氧化锌药物则经粪便排泄导致重金属污染,因此亟需寻找更为高效、环保的免疫预防方法。近年来多项研究表明,病原体RNA是一种重要的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),例如李斯特菌RNA、呼肠孤病毒RNA、仙台病毒RNA、非致病性大肠杆菌RNA都可以在人体或小鼠细胞中诱发天然免疫反应。然而,ETEC的PAMPs研究仅局限于蛋白质水平,如黏附素和肠毒素,而ETEC总RNA能否作为PAMPs诱导宿主产生免疫反应尚不明确。本研究旨在通过探索ETEC总RNA在细胞水平和动物水平引发的天然免疫和适应性免疫保护作用,为针对仔猪大肠杆菌病研发RNA类的疫苗佐剂或免疫增强剂奠定理论基础和提供新思路。首先,在细胞水平上,采用猪源ETEC菌体、ETEC总RNA分别刺激猪小肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cells,IPEC),ELISA结果表明,ETEC菌体和总RNA均可诱导IPEC细胞分泌IL-1β,产生天然免疫反应。其次,在动物水平,分别使用仔猪大肠埃希氏杆菌三价灭活疫苗、ETEC总RNA及PBS肌肉注射于小鼠模型,在免疫前、免疫后10天、免疫后20天采用ELISA方法检验血清IL-1β和免疫球蛋白水平。结果表明,ETEC总RNA注射组小鼠血清中IL-1β浓度显著高于PBS对照组(P<0.05)。ETEC总RNA注射组小鼠血清中IgG1、IgG2b、IgA和IgM浓度均显著高于PBS对照组(P<0.05)。其中RNA注射组小鼠血清中IgM平均浓度极显著高于疫苗组(P<0.01),是疫苗组和PBS组的2-3倍。以上结果证明ETEC总RNA可诱导小鼠模型产生高强度体液免疫反应。最后,使用仔猪大肠埃希氏杆菌三价灭活疫苗、ETEC总RNA、疫苗/RNA混合物及PBS接种于小鼠模型,在免疫后第23天进行ETEC攻毒试验,使用绝对致死量的ETEC腹腔注射于小鼠模型并连续观察5天。结果显示,RNA免疫组的小鼠存活率为75%,疫苗免疫组存活率为12.5%,疫苗/RNA混合免疫组小鼠存活率为75%,PBS阴性对照组小鼠存活率为0%,RNA免疫组及疫苗/RNA混合免疫组小鼠存活率均高于阴性对照组和疫苗免疫组。结果表明,接种ETEC总RNA对猪源ETEC感染小鼠模型有良好的保护效果,ETEC总RNA可显著提高疫苗的保护水平。此外,本研究还进一步检测了接种不同剂量ETEC总RNA对小鼠体液免疫的影响。试验结果显示,高剂量RNA免疫组的小鼠血清中IgG1、IgG2b、IgM和IgA均显著高于低剂量组(P<0.05)。在ETEC攻毒试验中,接种高剂量ETEC总RNA的小鼠存活率高于低剂量组。因此可以证实,ETEC总RNA对小鼠的免疫效果与RNA剂量成正相关。综上所述,本研究可得出结论:猪源ETEC总RNA可刺激猪小肠上皮细胞产生天然免疫反应,注射小鼠模型可产生体液免疫反应,针对ETEC感染有良好的免疫保护效果,其保护效果与ETEC总RNA的剂量成正相关。