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奶牛是经济价值较高的动物,实现对奶牛的性别控制必将大幅度的促进经济的增长,因此控制奶牛的性别显得越来越重要。控制牛的性别主要决定于对性别形成机制的了解,Y染色体性别决定基因(Sex-determining Region on the Y Chromosome,SRY)被认为是在性别决定调控级联反应中的主基因,同时缪勒氏管抑制因子(Mullerian Inhibiting Substance,MIS)也是哺乳动物性别决定所必须的。MIS抑制缪勒氏管(构成雌性动物的生殖结构)的形成,有研究表明MIS基因的表达可能是被SRY调节的。对于牛性别决定方面的研究很少,牛SRY是否对牛MIS基因的启动子有结合功能仍然不清楚,关于原核表达的牛SRY蛋白功能的研究未见报道。本实验以牛SRY蛋白对MIS基因的表达是否有调控功能为研究目的,对牛SRY基因进行了原核表达,克隆了牛、人、鼠的MIS基因启动子,并且研究了SRY蛋白与这些启动子的结合功能。这些实验必将在基因水平对奶牛进行性别控制有深远的意义。(1)提取雄性中国荷斯坦牛的基因组DNA,根据GengBank收录的奶牛SRY基因序列,设计了一对使扩增产物包括SRY基因编码区的引物(因SRY基因为单外显子基因,其编码区可直接用以基因组DNA为模板的PCR反应获得),将扩增产物连接至pGEM-T载体,送至生物公司进行序列分析。结果显示,已经获得了中国荷斯坦牛SRY基因的编码区全长,基因编码区与GeneBank收录的奶牛SRY基因同源性达到100%。(2)根据牛SRY基因编码区和pET-28a(+)载体设计一对分别带有酶切位点EcoRⅠ和SalⅠ的引物,以构建好的pGEM-T/SRY载体为模板继续扩增SRY基因编码区,使SRY基因编码区两端带上酶切位点;将获得的PCR产物和pET-28a(+)载体同时进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,并用T4 DNA连接酶连接两种酶切产物,构建表达载体pET-28a/SRY;将表达载体转化至E.coli BL21(DE3),送至生物公司进行序列分析,分析结果表明成功构建了pET-28a/SRY表达载体。用IPTG对含有pET-28a/SRY表达载体的E.coli BL21(DE3)进行诱导,使其表达目的蛋白SRY,对表达结果进行SDS-PAGE电泳检测,发现在33 ku处出现一条浓度较大的条带,表明目的蛋白获得表达。用His-单抗对表达产物进行Western Blot检测,结果显示为阳性,而对照组为阴性,进一步证明了目的蛋白SRY得到了表达。(3)利用带有His标签的融合蛋白可以与Ni结合的原理,用Ni-NTA蛋白纯化柱对牛SRY蛋白进行纯化,得到了纯度较高的SRY目的蛋白。分别以牛、人、鼠的血样为材料,进取基因组DNA;根据文献中的牛、人、鼠的MIS基因启动子序列,设计三对使扩增产物包含MIS基因启动子的引物,并对三种启动子进行扩增,扩增产物经纯