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研究背景糖尿病心肌病可增加糖尿病患者心力衰竭甚至死亡的发生风险。尽管有大量关于糖尿病心肌病的研究,目前尚无特定有效的治疗方法,且现存的改善血糖及心功能的药物并未显著降低糖尿病心肌病的发病率。近年来,大量研究表明糖尿病患者存在维生素D缺乏,而维生素D缺乏与糖尿病心血管并发症发生风险显著相关。维生素D除与免疫反应、感染、肿瘤及代谢性疾病相关外,研究显示维生素D还参与自噬调节。自噬对心脏形态及功能的维持具有重要作用,在1型及2型糖尿病中皆存在自噬调节异常。经典Wnt/β-catenin通路与心脏重塑、心肌肥厚及间质纤维化密切相关,研究发现该通路可能也参与糖尿病心肌病的发病过程。且β-catenin能通过其C端与VDR的第二激动功能区(AF-2)发生相互作用,β-catenin表达升高可促进1,25D3转录活性。此外,研究显示β-catenin通路的活化还可通过抑制GSK-3β来激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)的表达。m TOR不仅参与成人心功能的调控,还是自噬通路调节的关键组分。研究目的(1)在大鼠H9C2细胞中探讨高浓度葡萄糖对心肌细胞肥大及自噬的影响;观察1,25D3干预对高糖介导的心肌细胞自噬及心肌细胞肥大的作用。(2)构建1型糖尿病大鼠模型及慢病毒转染沉默VDR基因表达(Lenti-sh VDR)大鼠模型,观察各组大鼠心肌自噬水平及心脏结构和功能的变化;探讨1,25D3或联合Lenti-sh VDR或氯喹(CQ)处理对糖尿病大鼠心肌自噬及其心脏结构和功能的影响。(3)在高糖培养的H9C2细胞和糖尿病大鼠模型中探讨β-catenin/TCF4/GSK-3β/m TOR通路是否参与糖尿病心肌病发病过程,以及1,25D3保护糖尿病心肌的可能机制。研究方法(1)培养H9C2细胞,观察不同浓度葡萄糖(5.5、15、25、35mmol/L)及不同浓度1,25D3(25、50、100、200、400 n M)处理对心肌细胞自噬及心肌细胞活力的影响,筛选最佳干预浓度;联合自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)处理细胞,探讨1,25D3对高糖介导的心肌细胞自噬的作用;应用Western blot检测心肌细胞中VDR、LC3-II/I、P62及Beclin 1蛋白表达;应用免疫荧光检测VDR在细胞中的表达和分布;应用透射电镜观察自噬体形成。(2)应用STZ构建1型糖尿病大鼠模型,随机分为7组:正常对照组(NG)、糖尿病组(DM)、糖尿病+1,25D3组(DM+VD3)、糖尿病+1,25D3+lenti-sh VDR组(DM+VD3+sh VDR)、糖尿病+lenti-sh VDR组(DM+sh VDR)、糖尿病+1,25D3+氯喹组(DM+VD3+CQ)及糖尿病+氯喹组(DM+CQ)。1,25D3或联合CQ干预8周后,应用心脏彩超及无创鼠尾套袖体积描计法系统检测大鼠心脏功能及血压的变化;称取大鼠体重、心重并测量胫骨长度;检测大鼠空腹血糖、血清胰岛素、血清胆固醇、甘油三脂、肌酐、血钙水平;ELISA法检测大鼠血清及尿白蛋白、甲状旁腺激素(PTH)及25(OH)D水平;应用荧光显微镜观察Lenti-sh VDR转染大鼠后其心脏、肝脏及肾脏中绿色荧光蛋白表达;HE染色及天狼星红染色观察各组大鼠心脏组织结构的病理改变;透射电镜观察大鼠心脏超微结构改变;免疫组化检测大鼠心肌组织中LC3B及P62蛋白表达;Western blot检测大鼠心肌组织中VDR、LC3-II/I、P62、Beclin 1、β-catenin、TCF4、c-myc、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser 9)、m TOR及p-m TOR蛋白表达;应用q RT-PCR检测各组大鼠心肌组织中VDR、β-MHC、ANF、BNP、β-catenin、TCF4及c-myc m RNA表达水平。(3)在高糖培养的H9C2细胞中,联合1,25D3及β-catenin通路活化剂氯化锂(Li Cl)干预细胞,并分为6组:正常对照组(NG,5.5mmol/L)、NG+Li Cl组(NG+Li Cl)、高糖组(HG,25mmol/L)、高糖+Li Cl组(HG+Li Cl)、高糖+1,25D3组(HG+VD3)、高糖+1,25D3+Li Cl组(HG+VD3+Li Cl)。应用q RT-PCR检测各组细胞VDR、β-MHC、ANF、BNP、β-Catenin、TCF4及c-myc m RNA表达水平;Western blot检测VDR、LC3-II/I、P62、Beclin 1、β-catenin、TCF4、c-myc、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser 9)、m TOR及p-m TOR蛋白表达;应用免疫荧光观察β-catenin在心肌细胞中的表达及分布;应用透射电镜检测自噬体形成。研究结果(1)在H9C2细胞中,与葡萄糖浓度为5.5 m M及15 m M组相比,高糖组(25及35mmol/L)细胞中LC3-II/I及Beclin 1蛋白表达明显降低,而P62蛋白表达升高;1,25D3浓度依赖性地增加HG组(25mmol/L)细胞中LC3-II/I及Beclin 1蛋白表达水平及心肌细胞自噬体形成,并降低P62蛋白表达。1,25D3的上述作用在浓度为100、200和400 n M时无明显差异;联合1,25D3(100n M)及巴弗洛霉素A1(Baf)干预后,与HG+VD3组相比,HG+Baf+VD3组细胞自噬体形成增加,且LC3-II/I及P62表达水平进一步升高。(2)与NG组相比,STZ处理组大鼠血糖明显升高,而血清胰岛素及大鼠体重降低。与NG及DM+VD3组相比,其他各组大鼠尿白蛋白及血清总胆固醇浓度升高,但血清白蛋白及甘油三酯浓度无明显差异。与NG组相比,DM及DM+CQ组大鼠血清25(OH)D浓度明显降低,应用1,25D3干预后两组大鼠血清25(OH)D水平升高。尽管沉默大鼠心肌组中VDR表达升高了血清25(OH)D及PTH水平,但各组大鼠血钙浓度无明显差异。此外,各组大鼠的血压及心率也无明显差异。(3)与NG相比,DM组大鼠心重/体重、心重/胫骨长度明显增加。心脏彩超提示糖尿病大鼠左室收缩及舒张末期内径增加、容积增大,左室射血分数、缩短分数及E/A比值减低;HE染色及天狼星红染色提示糖尿病大鼠心肌细胞排列紊乱伴间质纤维化;透射电镜显示心肌纤维破坏,伴线粒体肿胀、排列紊乱。应用1,25D3干预8周后糖尿病大鼠上述心脏结构及功能明显改善。但应用慢病毒转染沉默VDR基因表达或联合自噬抑制剂氯喹(CQ)干预后,上述1,25D3对糖尿病大鼠心脏结构及功能的改善作用消失。(4)与NG组相比,DM组大鼠心肌组织中LC3-II/I及Beclin 1蛋白表达明显降低,而P62蛋白表达升高。应用1,25D3干预后糖尿病大鼠心肌组织中LC3-II/I及Beclin1蛋白表达增加,而P62蛋白表达降低。联合1,25D3及CQ干预后进一步增加糖尿病大鼠心肌组织中LC3-II/I及P62蛋白表达水平,而沉默VDR基因则抵消了1,25D3对糖尿病大鼠心脏自噬的促进作用。(5)与NG组相比,DM组大鼠心肌组织中β-catenin、TCF4和c-myc m RNA和蛋白表达水平明显升高,p-GSK-3β/GSK-3β和p-m TOR/m TOR蛋白表达也增加;应用1,25D3干预降低了β-catenin、TCF4和c-myc m RNA和蛋白表达水平,以及p-GSK-3β/GSK-3β和p-m TOR/m TOR蛋白表达水平;1,25D3的上述作用在沉默糖尿病大鼠VDR基因表达后消失。(6)在高糖培养的H9C2细胞中,与NG组相比,HG组细胞β-catenin、TCF4和c-myc m RNA和蛋白表达明显升高,p-GSK-3β/GSK-3β和p-m TOR/m TOR蛋白表达增加,表明高糖诱导H9C2细胞中β-catenin/TCF4/GSK-3β/m TOR通路表达;应用1,25D3(100n M)处理细胞后抑制了高糖诱导的该通路的激活。此外,与HG+VD3组相比,联合Li Cl处理后细胞中ANF、BNP及β-MHC m RNA表达增加,LC3-II/I和beclin1蛋白表达降低,自噬体形成减少,而P62蛋白表达明显升高。结论(1)在H9C2细胞中,高糖可促进心肌细胞肥大并抑制心肌细胞自噬,1,25D3处理后抑制了高糖介导的心肌细胞肥大并恢复心肌自噬水平。(2)在STZ诱导的1型糖尿病大鼠中,糖尿病大鼠心脏自噬水平降低并出现心肌结构紊乱、间质纤维化和心功能障碍;1,25D3与VDR结合后可通过恢复心脏自噬部分改善糖尿病诱导的心脏结构紊乱和功能障碍。(3)在高糖培养的H9C2细胞和STZ诱导的1型糖尿病大鼠心脏中,β-catenin/TCF4/GSK-3β/m TOR通路表达增高,1,25D3与VDR结合后可抑制β-catenin/TCF4/GSK-3β/m TOR通路的表达;而联合1,25D3及Li Cl干预则抵消1,25D3对高糖培养的H9C2细胞自噬的促进作用,并引起心肌细胞肥大。综上,本课题研究结果显示1,25D3可显著改善糖尿病大鼠心功能障碍、心肌结构紊乱及间质纤维化。1,25D3可能是通过与VDR结合来抑制心肌组织中β-catenin/TCF4/GSK-3β/m TOR通路的表达,从而恢复心肌自噬水平,发挥对糖尿病心脏的保护作用。