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研究背景 心血管疾病是终末期肾脏病(ESRD)患者最常见的并发症。ESRD病人心血管疾病的死亡率是一般人群16.6-17.7倍。据美国肾脏病资料系统(USRDS)1999年统计，由心血管疾病所致的死亡占ESRD总死亡率的45％。我国ESRD的原发病因和年龄分布与西方国家有很大差异，但同年中华肾脏病学会透析移植登记报告表明，ESRD病人由心血管疾病所致的死亡率亦高达50％。因此，心血管疾病已成为影响ESRD病人生存率和致残率的最为重要的因素。 ESRD病人心血管疾病的发生率较一般人群高5～10倍。这类病人心血管病的发生率明显高于一般人群，发病年龄明显提前，被称之为“加速型动脉粥样硬化”。尽管导致心血管疾病的原因尚未完全阐明，但近10年临床流行病学研究已使我们对ESRD时心血管疾病的危险因素有了更深入的了解。已证实，ESRD病人存在多种导致心血管疾病的危险因素，包括高血压、糖尿病、高脂血症等见于一般人群的传统危险因素和一些与慢性尿毒症有关的因素，诸如贫血、容量负荷过度所致的血流动力学障碍以及低白蛋白血症、高同型半胱氨酸血症、氧化应激、炎症状态、二价离子紊乱等与尿毒症有关的代谢紊乱。因此，ESRD本身被认为是一种“血管病变状态”(vasculopathic state)。 我们和国外的研究表明，ESRD患者的循环晚期糖基化终产物（AGE）水平异常增高，在罹患有动脉粥样硬化的ESRD患者的血管壁中也检查到了AGE沉积。AGE是蛋白质氨基组与糖的醛基组之间非酶性糖化氧化反应的终产物。反应初期生成SChiff碱，经重排后生成相对稳定的酮胺，亦即inadori产物。后者进一步经过脱水、环化、氧化井重排后生成AGE。在体外试验中，AGE修饰蛋白具有促进内皮细胞表达粘附分于ICAM－l、VCAM－l及E－选择素，增加内皮通透性，降低内皮细胞一氧化氮合成酶（eNOS）活性、缩短 eNOS InRNA半衰期等作用。这些研究提示，AGE是一种对内皮细胞有重要病理生理作用的尿毒症毒素。 慢性肾功能衰竭时加速型动脉粥样硬化（AS）的发病机制目前尚未完全清楚，但近期研究结果表明，AS的本质是炎症反应。AS发病早期可分为两个阶段：（1）首先是在各种致病因素的作用下，内皮细胞的功能发生紊乱。内皮细胞合成释放的一氧化氮（NO）对于内皮细胞维持血管稳态具有非常重要的作用。NO是目前已知最重要的内皮细胞衍生的血管舒张因子，除血管扩张作用外，NO还对血管有多种作用，包括维持血管弹性，抑制由ADP诱导的血小板聚集并有效解聚血小板，抑制血小板、淋巴细胞、粒细胞和单核细胞粘附于血管内皮等。这些作用使NO成为一种重要的防护AS形成的因素。内皮细胞NO生成量或NO水平的变化必然会影响血管的正常防护机制，导致血管的结构和功能异常。而在AS患者，往往有NO的合成障碍，使得内皮细胞同血小板、炎症细胞的粘附性增加。（2）第二阶段，在内皮细胞表达释放的单核细胞趋化因子（MCP．l）以及粘附分子的作用下，单核细胞在受损伤区域聚集且向内皮下迁移，并同时也分泌MCP－l，使局部MCP－l浓度进一步增高，更多的单核细胞被吸引，从而使炎症反应放大。鉴于 NO和 MCPl在AS发病过程中的重要作用，我们假设，ESRD患者升高的AGE修饰蛋 2白可能通过对内皮细胞NO生成及MCP表达的影响，促进了ESRD患者心血管疾病的发生。本研究旨在观察AGE修饰蛋白对人血管内皮细胞合成、分泌一氧化氮（NO）和单核细胞趋化因于－l（MCP－l）的影响，并对上述作用的细胞内信号转导通路及分子机制进行探讨。研究方法 我们选择体外培养的人脐静脉内皮细胞及内皮细胞株ECV304为靶细胞，采用如下的方法观察AGE了修饰蛋白对血管内皮细胞功能的影响： 1．AGE修饰蛋白对内皮细胞合成NO的影响。门）内皮细胞接种在96孔培养板上，在无血清培养基中静止24h，分别加入12．SPg／tnl上5yg／Inl和 50pg／ml的 AGE－HSA或 AGE－BSA，作用 Zh、4h、sh、12h、24h。在每一时间点均设相同浓度HSA、BSA培养作为对照。培养上清NO的浓度用Gness法测定。所得结果以培养结束时相应各孔的细胞数作校正，而后以相应对照（作为100％）的百分数表示。（2）为了避免内毒素对实验结果的影响，我们观察了 100qg／llil多粘菌素 BoMX B功人后，AGE修饰蛋白对内皮细胞生成NO的影响。内皮细胞在无血清培养基中静止24h后，加入无血清培养基、50pg／Inl AGE－HSA、50pg／Illli，GE石SA并均同时加入 llq帅 PMX B共同培养 sh。与同样处理但不加 PMX B的试验组作对比。培养结束时测定培养上清NO水平。 2．AGE修饰蛋白对MCP合成的影响。培养细胞在无血清培养基中静止24h，分别加入12．spg／llil，25pglryil，50卜gltlil的A GEGE－HSA或AGE－BSA（以加入50卜glllil不含AGE的HSA或BSA为对照），于Zh，4h，sh，12h，24h，36h，48h收集细胞，提取蛋白。取50qg细胞蛋白行15阮SDS－聚丙烯酚胺凝胶电泳，电转印或半干转印至硝酸纤维素膜上。5％hST脱脂乳封闭?