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芥菜（Brassicajuncea）是芸薹属中重要的蔬菜作物，全国各地都有种植。芥菜从营养生长转向生殖生长需要经历成花转变。花期的提前或延迟，会影响生产栽培、品种选育和F1代制种。前期报道，HDA9去乙酰化作用于AGL19的组蛋白H3和H4，影响其染色质环境，然后两者共同影响FT的表达，从而导致花期推迟。但HDA9、AGL19是否可直接调控核心开花整合子SOC1、AGL24，目前并不清楚。本试验拟克隆芥菜BjuHDA9和BjuAGL19，通过酵母双杂交、pull-down、酵母单杂交、双萤光素酶检测等多种方法，深入研究BjuHDA9和BjuAGL19分别与开花整合子BjuSOC1和BjuAGL24的作用机制，为芥菜花期分子调控和“未熟抽薹”调节等奠定基础。试验结果如下： 1.BjuHDA9和BjuAGL19基因的克隆及生物信息学分析 以芥菜茎尖为试验材料，同源扩增得到BjuHDA9和BjuAGL19基因，分别为1284bp和666bp。其中BjuHDA9编码426个氨基酸，预测蛋白分子量为48.73kDa，理论等电点为5.26。BjuAGL19编码221个氨基酸，预测蛋白分子量为25.16kDa，理论等电点为8.94。 2.BjuHDA9和BjuAGL19基因的表达模式研究 BjuHDA9和BjuAGL19基因在根、茎、叶、花、花蕾五个组织里均有表达，其中BjuHDA9主要在叶中表达量较高，在茎中的表达相对较低；BjuAGL19的表达主要在根中。短日照条件下，BjuHDA9在各个组织中的表达量均有上升；而长日照和春化途径下，BjuHDA9的表达量下降。 3.BjuHDA9和BjuSOC1、BjuAGL24蛋白之间的互作分析 酵母双杂交试验表明，BjuSOC1不是BjuHDA9的靶蛋白，而BjuHDA9也不与BjuAGL24蛋白互作。Pull-down试验结果与酵母双杂交相一致，进一步证实了这一结论。 4.BjuAGL19与BjuSOC1、BjuAGL24蛋白之间的互作鉴定 酵母双杂交试验表明，BjuAGL19与BjuSOC1之间不存在相互作用，但BjuAGL24是BjuAGL19的靶蛋白，BjuAGL19可以直接与BjuAGL24相互作用。Pull-down试验结果与酵母双杂交结果相一致，进一步证实了这一结论。 5.BjuHDA9与BjuSOC1、BjuAGL24启动子互作检测 酵母单杂交表明，Y1HGold[（pAbAi-BjuSOC1）×（pGADT7-BjuHDA9）]能够在SD/-Leu/AbA100固体培养基上正常生长，而Y1HGold[（pAbAi-BjuAGL24）×（pGADT7-BjuHDA9）]能够在SD/-Leu/AbA350固体培养基上正常生长，说明BjuHDA9蛋白能与BjuSOC1和BjuAGL24启动子相互作用。双萤光素酶活性检测结果也表明，BjuHDA9蛋白与BjuSOC1和BjuAGL24启动子在植物体内存在互作。 进一步筛选BjuHDA9蛋白与BjuSOC1、BjuAGL24启动子的作用区域。酵母单杂交表明，Y1HGold[（pAbAi-BjuSOC1-3）×（pGADT7-BjuHDA9）]能够在SD/-Leu/AbA100固体培养基上正常生长，同时Y1HGold[（pAbAi-BjuAGL24-3）×（pGADT7-BjuHDA9）]能够在SD/-Leu/AbA350固体培养基上正常生长。双萤光素酶检测结果与酵母单杂交结果相一致，说明BjuHDA9蛋白能与BjuSOC1启动子截短体片段BjuSOC1-3相互作用，而BjuHDA9蛋白同样与BjuAGL24启动子截短体片段BjuAGL24-3能互作。 6.BjuAGL19与BjuSOC1、BjuAGL24启动子互作检测 酵母单杂交表明，Y1HGold[（pAbAi-BjuSOC1）×（pGADT7-BjuAGL19）]在SD/-Leu/AbA100固体培养基上不能长出白色菌斑，而Y1HGold[（pAbAi-BjuAGL24）×（pGADT7-BjuAGL19）]同样在SD/-Leu/AbA350固体培养基上不能长出白色菌斑，说明BjuAGL19蛋白与BjuSOC1和BjuAGL24启动子之间均不存在相互作用。双萤光素酶活性检测结果也表明，BjuAGL19蛋白与BjuSOC1和BjuAGL24启动子在植物体内没有相互作用。 7.BjuHDA9突变体与BjuSOC1、BjuAGL24启动子互作检测 试验分别选取芥菜BjuHDA9蛋白的第172、174和261这三个位点，利用重叠延伸PCR对选定的氨基酸位点进行定点突变，分别将这三个氨基酸置换为丙氨酸，研究结果发现BjuHDA9突变体仍能与BjuSOC1、BjuAGL24启动子相互作用，但作用强度减弱。