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卵巢是女性的主性器官,负责调控女性的生殖功能和生理健康。卵巢功能减退的主要病因包括:生理性,如卵巢功能自然衰老;病理性,如早发性卵巢功能不全、卵巢早衰等。卵巢功能对维持女性的各项生理活动至关重要,其功能的衰退,将导致女性出现围绝经期症状,身体多器官脏器将受到波及,如出现泌尿生殖道症状、骨密度降低导致的骨质疏松、心血管疾病等。但目前临床暂无根本性恢复卵巢功能的治疗方法。卵巢功能减退的病理生理学特点为:卵巢颗粒细胞凋亡水平上调和增殖水平降低,导致卵泡闭锁和失能。因此,调控卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡水平是改善卵巢功能的重要治疗机制。间充质干细胞及其来源的外泌体介导的各类治疗方法是目前再生医学领域研究的热点,多项研究已证实其在多种疾病治疗中的有效性。本研究旨在评价人脐带间充质干细胞来源的外泌体对卵巢功能减退的改善和治疗作用,并深入探讨其内在的分子机制。第一部分人脐带间充质干细胞鉴定及其来源外泌体的分离与鉴定目的:完成对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUCMSCs）的鉴定;并提取hUCMSC来源的外泌体（hUCMSC derived exosomes,hUCMSC-Exos）,进一步完成对hUCMSC-Exos的鉴定,确保hUCMSC-Exos提取成功并可用于后续细胞和动物实验。方法:1.hUCMSCs购自山东齐鲁细胞治疗工程技术有限公司。对hUCMSCs进行鉴定:使用倒置相差显微镜观察细胞形态;采用流式细胞学技术检测hUCMSCs表面标志物,包括阳性标志物CD73、CD105、CD44、CD90和阴性标志物CD34、CD45、HLA-DR;使用条件培养基诱导hUCMSCs成脂、成骨定向分化,并采用油红O和茜素红染色验证其定向分化结果。2.使用超速离心法提取hUCMSC-Exos,并对其进行鉴定:利用透射式电子显微镜观察其形状和结构;使用纳米颗粒跟踪分析技术检测其直径范围和颗粒浓度;使用流式细胞技术检测其表面标志物,包括CD9、CD63、CD81。结果:1.hUCMSCs细胞均匀贴壁生长,形态规整,呈长梭形,与典型的成纤维细胞形态学特征类似。间充质干细胞分子标志物CD73、CD105、CD44及CD90的阳性率分别为98.8%、98.1%、99.9%、99.9%,间充质干细胞阴性标志物CD34、CD45、HLA-DR表达率分别为0.4%、0.7%、0.2%。经过成脂成骨诱导培养基培养后,hUCMSCs成脂成骨定向分化成功,证实其具备多向分化能力。2.采用超速离心法分离获得hUCMSC-Exos,在透射电子显微镜下观察到外泌体为圆形或一侧凹陷或茶托样的含双层膜的微小囊泡,直径约30-100nm。纳米流式检测仪检测发现hUCMSC-Exos的平均直径为68.15nm,浓度为8.69×1010particles/ml。流式细胞技术检测结果显示,hUCMSC-Exos特异性表达外泌体标志蛋白:CD9、CD63、和CD81。结论:1.本阶段研究完成了hUCMSCs的形态学、表面标志物和多向分化能力的鉴定,鉴定结果符合标准。2.本阶段研究成功提取了hUCMSC-Exos,并使用透射电子显微镜、粒径分析和流式细胞技术对其进行了形态学、颗粒直径和外泌体标志蛋白的鉴定。3.本阶段研究建立了完整的hUCMSCs培养和鉴定的流程,成功提取出符合各项标准的hUCMSC-Exos,为后续实验研究奠定了基础。第二部分人脐带间充质干细胞来源的外泌体调控Hippo通路促进颗粒细胞增殖改善POI卵巢功能的研究目的:使用hUCMSC-Exos治疗早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）小鼠模型和体外颗粒细胞模型,验证其能否改善POI卵巢功能并探究内在治疗机制。方法:1.将36只8周雌性C57BL/6小鼠分为3组,在完成腹腔注射环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）造模后,给予hUCMSC-Exos治疗。治疗结束后每组处死6只小鼠,取卵巢组织和血清。HE染色检测卵巢大体形态和卵泡数量变化;ELISA检测激素水平变化;称量小鼠体重变化;免疫组织学染色检测增殖相关分子;Western Blot实验检测增殖相关分子和Hippo通路主要分子的表达水平。每组剩余6只小鼠进行合笼生殖实验,检测小鼠生育能力恢复情况。2.分离提取并鉴定小鼠卵巢颗粒细胞。使用CTX干预颗粒细胞构建体外细胞模型后,给予hUCMSC-Exos共孵育治疗。Ed U、CCK-8实验检测细胞增殖水平,Western Blot实验检测增殖相关分子水平表达水平。为了验证Hippo通路在此治疗中的重要作用,在hUCMSC-Exos与体外细胞模型共孵育时,加入Hippo通路关键分子Yes-associated protein（YAP）的抑制剂维替泊芬;在治疗和干预完成后,使用Ed U、CCK-8检测细胞增殖水平,Western Blot实验检测增殖相关分子和Hippo通路主要分子表达水平。结果:1.本阶段研究成功构建了小鼠POI模型,使用hUCMSC-Exos治疗POI小鼠后,相关激素水平恢复到接近正常水平,卵泡数量明显增加,生育能力部分恢复,卵巢内细胞的增殖水平明显升高。同时初步验证hUCMSC-Exos是通过调控Hippo通路来促进卵巢内细胞的增殖水平,进而改善POI小鼠的卵巢功能。2.本阶段研究完成了体外颗粒细胞造模,并使用YAP的抑制剂对hUCMSC-Exos治疗加以干预。在细胞实验中,hUCMSC-Exos同样通过调节Hippo通路改善并提高了颗粒细胞的功能和增殖水平。然而,这些治疗效果被YAP的抑制剂维替泊芬显著逆转。结论:1.本阶段研究成功完成了POI小鼠模型和体外细胞模型的构建。2.hUCMSC-Exos通过调控Hippo通路提高POI卵巢内颗粒细胞的增殖水平,进而改善卵巢功能。3.hUCMSC-Exos作为一种新兴的治疗方法,具备应用于临床治疗POI的广阔前景。第三部分人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制颗粒细胞凋亡改善NOA卵巢功能的研究目的:通过动物模型和体外颗粒细胞模型来验证hUCMSC-Exos能否改善生理性卵巢衰老（natural ovarian aging,NOA）的卵巢功能,并验证PTEN和凋亡水平在治疗过程中被调控的情况,进而深入探究具体的内在治疗分子机制。方法:1.将14月大的雌性C57BL/6小鼠设为NOA组,10周龄的雌性C57BL/6小鼠设为Normal组,给予hUCMSC-Exos治疗的NOA小鼠为Exos组。治疗完成后采集各组小鼠卵巢组织。HE染色检测卵巢组织形态和卵泡数量变化;Western Blot和PCR实验检测phosphatase and tensin homologdeleted on chromosome ten（PTEN）和凋亡相关分子（Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9）表达水平;TUNEL实验检测卵巢组织内细胞凋亡水平;Ed U检测卵巢组织增殖水平。2.培养人卵巢颗粒细胞系HO-23,构建体外颗粒细胞凋亡模型;建模完成后将hUCMSC-Exos与细胞模型共孵育,通过Western Blot和PCR实验检测PTEN和凋亡相关分子表达水平,并通过TUNEL实验检测细胞凋亡水平。3.使用高通量测序检测hUCMSC-Exos内高表达的miRNA分子,并通过生信分析寻找外泌体中够靶向调控PTEN的miRNA,而后验证该miRNA对PTEN和凋亡分子的调控机制。结果:1.在NOA小鼠卵巢组织中,HE染色结果证实NOA小鼠的卵巢形态萎缩,各级卵泡数量减少;Western Blot和PCR实验结果显示PTEN和凋亡正相关分子（Bax、Caspase-3、Caspase-9）表达显著上调,而凋亡负相关分子（Bcl-2）表达显著下调;TUNEL实验显示NOA卵巢组织凋亡水平较青壮年小鼠明显升高。在使用hUCMSC-Exos治疗NOA小鼠后,HE染色证实NOA小鼠的卵巢形态恢复,各级卵泡数量增多;Western Blot和PCR实验结果显示hUCMSC-Exos能够调控PTEN分子和凋亡相关分子的表达;TUNEL和Ed U实验证实hUCMSC-Exos能够下调NOA小鼠卵巢内的凋亡水平,同时上调其增殖水平。2.在人卵巢颗粒细胞系构建的细胞凋亡模型中,TUNEL实验证实细胞凋亡水平升高,Western Blot和PCR实验结果显示PTEN及凋亡正相关分子表达上调,证实细胞模型构建成功。使用hUCMSC-Exos与细胞凋亡模型共孵育后,Western Blot和PCR实验结果显示hUCMSC-Exos能够调控PTEN分子和凋亡相关分子的表达;TUNEL实验证实hUCMSC-Exos能够下调细胞模型的凋亡水平。3.对hUCMSC-Exos内包含的miRNA进行的高通量测序结果显示miR-21-5p是表达量最高的miRNA分子。PCR结果显示在hUCMSC-Exos中miR-21-5p表达水平显著高于miR-26a-5p。人颗粒细胞与hUCMSC-Exos共孵育后,胞内miR-21-5p表达水平升高。在使用hUCMSC-Exos与细胞模型共孵育的同时,加入miR-21-5p的inhibitor,PCR与Western Blot结果显示经过hUCMSC-Exos治疗后,人颗粒细胞凋亡水平和PETN表达水平较未治疗组明显降低,但在治疗的同时转染miR-21-5p inhibitor后,抗凋亡和抑制PETN表达的效果被逆转。结论:1.hUCMSC-Exos通过调控PTEN分子抑制颗粒细胞凋亡,改善NOA卵巢功能。2.miR-21-5p是hUCMSC-Exos中表达量最高的miRNA分子,其通过靶向抑制PTEN降低卵巢颗粒细胞凋亡水平。