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【目的】:
分析并鉴定龙须菜非琼脂活性多糖的理化特性，探讨龙须菜非琼脂活性多糖抗皮肤光老化引起色素沉着的作用及其机制，阐明龙须菜非琼脂活性多糖通过依赖于α-MSH/TYR通路抗皮肤光老化性色素沉着的新机制。为从海洋中寻找高效、低毒的天然活性产物作为美白护肤品的原料提供科学依据。
【方法】:
1.采用苯酚硫酸法测定龙须菜非琼脂活性多糖的总多糖含量，GPC凝胶渗透色谱检测其分子量的分布，HPLC分析其单糖的组成，用FITR鉴定该多糖化合物。
2.建立长波紫外UVA诱导黑素细胞光老化性色素沉着模型：将A375和B16-F10黑色素细胞分别接种培养，用PBS清洗细胞一遍后，加入适量的PBS以防细胞干死，并置于UVA光源正下方，分别给予不同的UVA辐射剂量，之后检测细胞的活性。
3.用MTT法检测龙须菜非琼脂活性多糖对有无UVA辐射A375和B16-F10细胞活力的影响，NaOH法检测其对黑素细胞中黑色素含量的影响，Fontana-masson染色实验观察黑色素生成的变化；L-DOPA法检测黑色素细胞内酪氨酸酶活性的影响；Westernblot法检测黑色素细胞内POMC、MC1R、TYR、TRP-1、TRP-2及MITF的表达水平。
4.构建A375人黑素细胞与HaCaT人角质形成细胞共培养模型，然后利用Transwell和细胞免疫荧光实验观察龙须菜非琼脂活性多糖对A375细胞内黑色素往角质形成细胞的迁移情况。
【结果】:
1.龙须菜非琼脂活性多糖的提取分离分析：用稀硫酸提取，除蛋白，透析，真空冷冻干燥处理，得到非琼脂活性多糖；测得非琼脂活性多糖的总糖含量为(65.2?5.28)%，其平均分子量为47600Da，峰值分子量为30970Da，由古洛糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成，红外光谱图有明显的多糖特征峰。
2.建立UVA致黑色素细胞光老化性色素沉着模型的实验，选取1.2J/cm2、2.4J/cm2、3.6J/cm2、4.8J/cm2的UVA剂量辐射黑色素细胞，结果显示，4.8J/cm2的UVA剂量对A375和B16-F10这两种黑色素细胞的抑制作用较为明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。
3.在体外培养的黑色素细胞实验中，以不同浓度的龙须菜非琼脂活性多糖处理黑色素细胞24h后，与对照组相比，无细胞毒性作用；此外，龙须菜非琼脂活性多糖还能明显减少UVA对黑色素细胞生长的抑制作用（P<0.05）。
4.龙须菜非琼脂活性多糖对UVA诱导A375和B16-F10细胞黑色素合成的影响实验，NaOH法和Fontana-masson染色实验结果表明，UVA辐射后能显著增加A375、B16-F10细胞的黑色素的含量，黑色素颗粒增多；龙须菜非琼脂活性多糖均能明显减少UVA诱导黑色素细胞合成的黑色素，其中0.25mg/ml、0.5mg/ml处差异有统计学意义（P<0.05）。
5.在龙须菜非琼脂活性多糖对UVA辐射A375和B16-F10细胞后酪氨酸酶活性影响的实验中，L-DOPA法实验结果显示，与UVA组相比，0.25mg/ml、0.5mg/ml的龙须菜非琼脂活性多糖能明显降低UVA辐射黑色素细胞后酪氨酸酶的活性，差异有统计学意义（P<0.05）。
6.选取0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml三个浓度的龙须菜非琼脂活性多糖用于Westernblot实验，药物作用24h后，再用4.8J/cm2的UVA剂量辐射。与无UVA辐射的空白对照组比较，UVA辐射组的MC1R、POMC、MITF、TYR、TRP-1和TRP-2蛋白表达量均增加；与UVA组比较，各给药组的MC1R、POMC、MITF、TYR、TRP-1和TRP-2蛋白表达量均明显降低。
7.Transwell和细胞免疫荧光实验结果显示，龙须菜非琼脂活性多糖可有效抑制A375细胞分泌的黑素小体往HaCaT角质形成细胞中转移。
【结论】:
1.龙须菜非琼脂多糖的总糖含量为(65.2?5.28)%，平均分子量为47600Da，峰值分子量为30970Da；其单糖组成为：1.69%古洛糖醛酸、5.30%甘露糖、2.71%核糖、2.22%鼠李糖、14.72%氨基葡萄糖、0.58%氨基半乳糖、8.26%葡萄糖、62.08%半乳糖、0.68%阿拉伯糖和1.76%岩藻糖，红外光谱图表明提取物具有明显的多糖特征峰。
2.龙须菜非琼脂活性多糖能降低UVA辐射引起黑色素细胞生长的抑制作用，减少UVA诱导的黑色素生成和酪氨酸酶活性。
3.龙须菜非琼脂活性多糖调控光老化性色素沉着的机制可能为：抑制真黑素前体POMC及α-MSH的受体MC1R，下调MITF、TYR、TRP-1和TRP-2蛋白的表达；以及抑制黑素从黑色素细胞向角质形成细胞的转移。
分析并鉴定龙须菜非琼脂活性多糖的理化特性，探讨龙须菜非琼脂活性多糖抗皮肤光老化引起色素沉着的作用及其机制，阐明龙须菜非琼脂活性多糖通过依赖于α-MSH/TYR通路抗皮肤光老化性色素沉着的新机制。为从海洋中寻找高效、低毒的天然活性产物作为美白护肤品的原料提供科学依据。
【方法】:
1.采用苯酚硫酸法测定龙须菜非琼脂活性多糖的总多糖含量，GPC凝胶渗透色谱检测其分子量的分布，HPLC分析其单糖的组成，用FITR鉴定该多糖化合物。
2.建立长波紫外UVA诱导黑素细胞光老化性色素沉着模型：将A375和B16-F10黑色素细胞分别接种培养，用PBS清洗细胞一遍后，加入适量的PBS以防细胞干死，并置于UVA光源正下方，分别给予不同的UVA辐射剂量，之后检测细胞的活性。
3.用MTT法检测龙须菜非琼脂活性多糖对有无UVA辐射A375和B16-F10细胞活力的影响，NaOH法检测其对黑素细胞中黑色素含量的影响，Fontana-masson染色实验观察黑色素生成的变化；L-DOPA法检测黑色素细胞内酪氨酸酶活性的影响；Westernblot法检测黑色素细胞内POMC、MC1R、TYR、TRP-1、TRP-2及MITF的表达水平。
4.构建A375人黑素细胞与HaCaT人角质形成细胞共培养模型，然后利用Transwell和细胞免疫荧光实验观察龙须菜非琼脂活性多糖对A375细胞内黑色素往角质形成细胞的迁移情况。
【结果】:
1.龙须菜非琼脂活性多糖的提取分离分析：用稀硫酸提取，除蛋白，透析，真空冷冻干燥处理，得到非琼脂活性多糖；测得非琼脂活性多糖的总糖含量为(65.2?5.28)%，其平均分子量为47600Da，峰值分子量为30970Da，由古洛糖醛酸、甘露糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成，红外光谱图有明显的多糖特征峰。
2.建立UVA致黑色素细胞光老化性色素沉着模型的实验，选取1.2J/cm2、2.4J/cm2、3.6J/cm2、4.8J/cm2的UVA剂量辐射黑色素细胞，结果显示，4.8J/cm2的UVA剂量对A375和B16-F10这两种黑色素细胞的抑制作用较为明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。
3.在体外培养的黑色素细胞实验中，以不同浓度的龙须菜非琼脂活性多糖处理黑色素细胞24h后，与对照组相比，无细胞毒性作用；此外，龙须菜非琼脂活性多糖还能明显减少UVA对黑色素细胞生长的抑制作用（P<0.05）。
4.龙须菜非琼脂活性多糖对UVA诱导A375和B16-F10细胞黑色素合成的影响实验，NaOH法和Fontana-masson染色实验结果表明，UVA辐射后能显著增加A375、B16-F10细胞的黑色素的含量，黑色素颗粒增多；龙须菜非琼脂活性多糖均能明显减少UVA诱导黑色素细胞合成的黑色素，其中0.25mg/ml、0.5mg/ml处差异有统计学意义（P<0.05）。
5.在龙须菜非琼脂活性多糖对UVA辐射A375和B16-F10细胞后酪氨酸酶活性影响的实验中，L-DOPA法实验结果显示，与UVA组相比，0.25mg/ml、0.5mg/ml的龙须菜非琼脂活性多糖能明显降低UVA辐射黑色素细胞后酪氨酸酶的活性，差异有统计学意义（P<0.05）。
6.选取0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml三个浓度的龙须菜非琼脂活性多糖用于Westernblot实验，药物作用24h后，再用4.8J/cm2的UVA剂量辐射。与无UVA辐射的空白对照组比较，UVA辐射组的MC1R、POMC、MITF、TYR、TRP-1和TRP-2蛋白表达量均增加；与UVA组比较，各给药组的MC1R、POMC、MITF、TYR、TRP-1和TRP-2蛋白表达量均明显降低。
7.Transwell和细胞免疫荧光实验结果显示，龙须菜非琼脂活性多糖可有效抑制A375细胞分泌的黑素小体往HaCaT角质形成细胞中转移。
【结论】:
1.龙须菜非琼脂多糖的总糖含量为(65.2?5.28)%，平均分子量为47600Da，峰值分子量为30970Da；其单糖组成为：1.69%古洛糖醛酸、5.30%甘露糖、2.71%核糖、2.22%鼠李糖、14.72%氨基葡萄糖、0.58%氨基半乳糖、8.26%葡萄糖、62.08%半乳糖、0.68%阿拉伯糖和1.76%岩藻糖，红外光谱图表明提取物具有明显的多糖特征峰。
2.龙须菜非琼脂活性多糖能降低UVA辐射引起黑色素细胞生长的抑制作用，减少UVA诱导的黑色素生成和酪氨酸酶活性。
3.龙须菜非琼脂活性多糖调控光老化性色素沉着的机制可能为：抑制真黑素前体POMC及α-MSH的受体MC1R，下调MITF、TYR、TRP-1和TRP-2蛋白的表达；以及抑制黑素从黑色素细胞向角质形成细胞的转移。