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背景与目的:成纤维细胞是器官纤维化的重要效应细胞,其活化可促进器官纤维化的发生发展。肺成纤维细胞是各种原因引起的肺纤维化的重要参与者,其活化主要表现为肺成纤维细胞异常增殖,并分化为高表达α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）蛋白如I型胶原蛋白和III型胶原蛋白等的肺肌成纤维细胞。骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）是转化生长因子-β（transformation growth factor-beta,TGF-β）超家族成员之一。近来研究报道BMP9在成纤维型细胞活化中具有重要的调控作用,但具体效应仍存在争议。二甲双胍是一种较为安全的治疗2型糖尿病的一线药物,其主要通过激活细胞能量感受器单磷酸腺苷活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）而发挥其药理作用。近来研究结果表明,二甲双胍在肺纤维化中亦发挥作用,但其机制尚未明确。同时,有研究表明AMPK与BMPs信号通路在调控某些生物学事件如血管生成、成骨分化的过程中存在信号对话。故本课题以人胚肺成纤维细胞株HFL-1为细胞模型:（1）明确BMP9在HFL-1细胞增殖与分化中的作用及其对下游信号分子表达的影响;（2）明确二甲双胍对BMP9介导的HFL-1细胞增殖与分化的影响及可能的分子机制。方法:1探讨BMP9对HFL-1细胞的增殖与分化及其下游信号分子表达的影响1.1 BMP9对HFL-1细胞的增殖与分化及其下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法检测不同浓度（0、2、10和50 ng/ml）BMP9处理72 h及50 ng/ml BMP9不同时间（24、48和72 h）对HFL-1细胞增殖的影响。（2）平板克隆形成实验检测不同浓度（0、2、10和50 ng/ml）BMP9对HFL-1细胞克隆形成的影响。（3）Western Blot法检测不同浓度（0、2、10和50 ng/ml）BMP9处理48 h及10ng/ml BMP9不同时间（24和48 h）对HFL-1细胞分化标志蛋白ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III表达的影响。（4）Western Blot法检测不同浓度（0、2、10和50 ng/ml）BMP9处理24 h及10 ng/ml BMP9不同时间（0.5、1和2 h）对HFL-1细胞中BMP9信号下游分子ALK1和p-Smad1/5蛋白表达的影响。1.2 BMP受体抑制剂对HFL-1细胞的增殖与分化及下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法检测不同浓度（0.1、0.5和1μM）Dorsomorphin对HFL-1细胞增殖的影响。（2）平板克隆形成实验检测Dorsomorphin（0.1μM）对HFL-1细胞克隆形成的影响。（3）Western Blot法及Real-Time q PCR法检测Dorsomorphin（1μM）对HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III表达的影响。（4）Western Blot法检测Dorsomorphin（1μM）对HFL-1细胞中BMP9信号下游分子ALK1和p-Smad1/5蛋白表达的影响（5）Real-Time q PCR法检测Dorsomorphin（1μM）对HFL-1细胞中BMP9信号下游分子ID1和ID2 m RNA表达的影响。2探讨二甲双胍对BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化的影响及机制2.1二甲双胍对BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化及其下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法检测不同浓度（1、5和10 m M）二甲双胍联合BMP9对HFL-1细胞增殖的影响。（2）平板克隆形成实验检测不同浓度（1、5和10 m M）二甲双胍联合BMP9对HFL-1细胞克隆形成的影响。（3）Western Blot法检测不同浓度（1、5和10 m M）二甲双胍联合BMP9对HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III表达的影响;Real-Time q PCR法检测二甲双胍（1 m M）联合BMP9对HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III m RNA水平的影响。（4）Western Blot法检测不同浓度（1、5和10 m M）二甲双胍联合BMP9对HFL-1细胞ALK1和p-Smad1/5蛋白表达的影响;Real-Time q PCR法检测二甲双胍（1 m M）联合BMP9对HFL-1细胞ID1和ID2 m RNA表达的影响。2.2 AMPK突变体在二甲双胍对BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化及其下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法检测AMPK活化突变体AMPK-CA及AMPK负性突变体AMPK-DN分别联合BMP9对HFL-1细胞增殖的影响。（2）Western Blot法检测AMPK-CA及AMPK-DN分别联合BMP9对HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III表达的影响。（3）Western Blot法检测AMPK-CA及AMPK-DN分别联合BMP9对HFL-1细胞中ALK1和p-Smad1/5表达的影响。结果:1 BMP9对HFL-1细胞的增殖与分化及其下游信号分子表达的影响1.1 BMP9对HFL-1细胞的增殖与分化及下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法结果显示:10和50 ng/ml BMP9均明显促进HFL-1细胞的增殖,呈浓度依赖性（P<0.05;P<0.001）;50 ng/ml BMP9呈时间依赖性增加HFL-1细胞增殖（均P<0.001）。（2）平板克隆形成实验结果显示:10和50 ng/ml BMP9均明显增加HFL-1细胞克隆形成的数目,呈浓度依赖性（均P<0.05）。（3）Western Blot结果显示:10和50 ng/ml BMP9均明显增加HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III蛋白的表达,呈浓度依赖性;10 ng/ml BMP9呈时间依赖性上调HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III蛋白的表达。（4）Western Blot结果显示:2、10和50 ng/ml BMP9均明显促进ALK1、p-Smad1/5蛋白的表达,呈浓度依赖性;10 ng/ml BMP9在0.5和1 h均明显上调ALK1、p-Smad1/5蛋白的表达,但p-Smad1/5蛋白在2h时表达较1 h时下降。1.2 BMP受体抑制剂对HFL-1细胞的增殖与分化及下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法结果显示:0.1、0.5和1μM Dorsomorphin均明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞增殖,呈浓度依赖性（均P<0.001）。（2）平板克隆形成实验结果显示:Dorsomorphin（0.1μM）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞克隆形成的数目（P<0.01）。（3）Western Blot结果显示:Dorsomorphin（1μM）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III蛋白的表达;Real-Time q PCR结果显示:Dorsomorphin（1μM）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞分化标志ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III m RNA的表达（均P<0.01）。（4）Western Blot结果显示:Dorsomorphin（1μM）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞下游信号分子ALK1、p-Smad1/5蛋白的表达;Real-Time q PCR结果显示Dorsomorphin（1μM）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞下游信号分子ID1、ID2 m RNA的表达（均P<0.01）。2二甲双胍对BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化的影响及可能的分子机制2.1二甲双胍对BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化及其下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法结果显示:1、5和10 m M二甲双胍抑制BMP9诱导的HFL-1细胞的增殖,呈浓度依赖性（P<0.001;P<0.01;P<0.05）。（2）平板克隆形成实验结果显示:1、5和10 m M二甲双胍抑制BMP9诱导的HFL-1细胞克隆形成的数目,呈浓度依赖性（均P<0.05）。（3）Western Blot结果显示:5和10 m M二甲双胍抑制BMP9诱导的HFL-1细胞的分化标志蛋白ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III的表达,呈浓度依赖性;Real-Time q PCR结果显示:二甲双胍（1 m M）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞的分化标志ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III m RNA的表达（均P<0.05）。（4）Western Blot结果显示:5和10 m M二甲双胍处理24 h及10 m M二甲双胍处理8和24 h均抑制BMP9诱导的HFL-1细胞下游信号分子ALK1、p-Smad1/5的表达且激活p-AMPK蛋白的表达,呈浓度依赖性及时间依赖性;Real-Time q PCR结果显示:二甲双胍（1 m M）明显抑制BMP9诱导的HFL-1细胞下游信号分子ID1、ID2 m RNA的表达（均P<0.01）。2.2 AMPK突变体在二甲双胍对BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化及其下游信号分子表达的影响（1）CCK-8法结果显示:AMPK-CA抑制BMP9诱导的HFL-1细胞的增殖（P<0.01）;AMPK-DN挽救二甲双胍对HFL-1细胞增殖的抑制效应（P<0.001）。（2）Western Blot结果显示:AMPK-CA抑制BMP9诱导的HFL-1细胞分化标志蛋白ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III及下游信号分子ALK1、p-Smad1/5的表达;AMPK-DN联合二甲双胍组上调BMP9诱导的HFL-1细胞分化标志蛋白ɑ-SMA、Collagen I、Collagen III及下游信号分子ALK1、p-Smad1/5的表达。结论:1.BMP9能诱导HFL-1细胞的增殖与分化,其作用可能是通过ALK1/Smad1/5通路而实现的。2.二甲双胍能抑制BMP9诱导的HFL-1细胞增殖与分化,其作用可能是通过激活AMPK抑制ALK1/Smad1/5通路而实现的。