【摘 要】
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为维持生物体正常结构与功能,细胞分裂以一个完整的周期进行,并受到精确调控。这一调控主要通过蛋白质激酶介导的信号转导方式完成,其中cyclinE/Cdk2在细胞周期G1/S检验点的
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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为维持生物体正常结构与功能,细胞分裂以一个完整的周期进行,并受到精确调控。这一调控主要通过蛋白质激酶介导的信号转导方式完成,其中cyclinE/Cdk2在细胞周期G1/S检验点的转换中发挥关键作用。目前己发现一些蛋白在G1/S检验点被cyclinE/Cdk2复合物磷酸化而行使功能,但cyclinE/Cdk2调控细胞周期的详尽信号机制尚不明确。
为进一步阐明cyclinE/Cdk2复合物在G1/S转换点的功能,前期工作通过TAP亲和纯化技术筛选到与cyclinE/Cdk2相互作用的一种新蛋白PHF8(PHDfingerprotein8)。通过免疫共沉淀技术和GST-Pulldown技术,我们证实了PHF8蛋白和cyclinE/Cdk2存在相互作用,并且通过构建突变体发现这种结合依赖于PHF8上381-383位RGL特殊结构域。
通过体外激酶实验研究cyclinE/Cdk2复合物对PHF8及其突变体的磷酸化作用,证实PHF8是cyclinE/Cdk2复合物的底物,还发现PHF8Thr771位突变会使其减弱,提示PHF8上存在多个磷酸化位点。
为研究PHF8蛋白的特性及功能,制备了兔抗PHF8多克隆抗体。免疫印迹实验发现PHF8蛋白在细胞周期各时期均有表达,表达水平基本恒定。免疫荧光染色实验发现PHF8定位于细胞核。利用RNAi干扰技术、四环素特异性诱导表达PHF8蛋白的稳定细胞株及流式细胞分析,发现细胞内PHF8的降低会抑制细胞进入S期,而PHF8的过量表达在一定程度上能促进细胞G1/S起的转换,其详细的分子机制有待于进一步的研究。
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