论文部分内容阅读
目的:研究微血管内皮细胞(MEC)对造血干细胞(HSC)增殖的影响,寻找促进HSC增殖的方法。方法:1.MEC分离、培养及鉴定:将肺组织经I型胶原酶消化获得的细胞,在20%FBS、2ng/mlVEGF、肝素100u/ml、DMEM-F12中培养,24h全换液,此后每2-3天全量换液,镜下观察细胞形态变化及生长情况,取第8天细胞进行FITC-CD31免疫荧光鉴定,“铺路石”细胞用于流式鉴定、传代培养和共培养。连续8天观察P1代MEC生长情况、形态变化,并逐日细胞计数,绘制P1代MEC生长曲线。2.GFP小鼠HSC的分离、鉴定:密度梯度离心法获得小鼠骨髓单个核细胞(MNC),MACS-CD117+磁珠分选HSC。应用流式细胞计数仪(FACS)检测阳性细胞的纯度及HSC CD117CD34共表达率。3.微血管内皮细胞对造血干细胞增殖的研究:设立对照组(HSC)、共培养组(MEC+HSC),体外培养7天,观察HSC生长情况、细胞计数、绘制生长曲线、计算HSC扩增倍数。收集共培养组HSC,FACS检测共培养组HSC CD117CD34共表达率,与共培养前对比。结果:1.MEC分离、培养及鉴定:?原代细胞:6h贴壁,24h少数细胞形态不规则,多数细胞呈圆形。48h见多角形、短梭形细胞。第3d细胞聚集生长,形成形态大小较一致的细胞团。第6d相邻细胞伪足彼此相连,第10d细胞继续增多,第14d细胞生长达80%融合,呈“铺路石”外观。?传代细胞:4h贴壁,P1代MEC第3d见多角形、短梭形细胞。第4d细胞聚集生长,形成形态大小较一致的细胞团,第7d细胞密集生长,多数呈梭形、不规则形。第8d细胞生长近80%融合。p1代mec生长曲线:第4到7天为对数生长期,随后进入平台期。cd31抗体免疫荧光检测阳性率为54.5%。mecfacs鉴定vwf、cd31、cd34、cd45表达率分别为:81.39%、45.8%、57.48%、0.17%。2.gfp小鼠hsc的分离、鉴定:本实验中平均每只gfp小鼠骨髓经密度梯度离心后可以获得约1.1×108个mnc,活细胞率为98%。mnc经macscd117磁珠分选后可以获得约4.7×105个cd117+细胞,活率为97%。骨髓mnc中cd117+细胞含量约0.43%。磁珠分选后的cd117+hsc纯度为99.51%,hsccd117cd34共表达率为75.28%。荧光显微镜下:hsc呈绿色,圆形,大小均一。3.微血管内皮细胞对造血干细胞增殖的研究:培养时间增加,两组hsc数均增加,共培养组较对照组更明显。共培养组与对照组细胞数的比值:第1d,共培养组细胞数约为对照组的1.21倍(p<0.01),第2d,共培养组约为对照组的1.35倍(p<0.05),第3d,共培养组约为对照组的1.50倍(p<0.01),第4d,共培养组约为对照组的1.72倍(p<0.01),第5d,共培养组约为对照组的1.71倍(p<0.01),第6d,共培养组约为对照组的1.75倍(p<0.01),第7d,共培养组约为对照组的1.78倍(p<0.01)。共培养组与对照组细胞数比值变化曲线示:比值逐渐增加,第4d变化最明显。d1-d7较d0的hsc数比较:第7d与第0d相比,共培养组扩增约12.31倍(p<0.01),对照组扩增约6.92倍(p<0.01);第6d与第0d相比,共培养组扩增约11.28倍(P<0.01),对照组扩增约6.45倍(P<0.01);第5d与第0d相比,共培养组扩增约9.72倍(P<0.01),对照组扩增约5.66倍(P<0.01);第4d与第0d相比,共培养组扩增约7.31倍(P<0.01),对照组扩增约4.25倍(P<0.01);第3d与第0d相比,共培养组扩增约3.45倍(P<0.01),对照组扩增约2.30倍(P<0.01);第2d与第0d相比,共培养组扩增约1.92倍(P<0.01),对照组扩增约1.42倍(P<0.01);第1d与第0d相比,共培养组扩增约1.20倍(P<0.01),对照组扩增约0.99倍(P>0.05)。共培养7天后,共培养组HSC CD117CD34共表达率为92.06%。结论:1.微血管内皮细胞对造血干细胞增殖有促进作用,共培养第4天促进作用最明显。2..微血管内皮细胞可以促进造血干细胞CD34的表达。