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目的前包钦格复合体(pre-B?tzinger complex,pre-B?tC)是产生呼吸节律的关键部位,与心血管功能相关的儿茶酚胺能C1神经元群共同位于大鼠延髓腹外侧区(ventrolateral medulla,VLM)内,且位置很大程度上重叠。研究已证明,VLM儿茶酚胺能神经元的激活可以促进呼吸节律的发生,产生兴奋性调节作用并刺激心跳活动,提示C1和pre-B?tC的神经元,在心血管及呼吸活动过程中,可能通过神经递质的传递,共同参与呼吸功能的调控,但目前尚无形态学证据。pre-B?tC可以表达高水平的神经激肽1受体(neurokinin 1 receptor,NK1R),如果同时损伤双侧80%以上的NK1R免疫反应(NK1R immunoreactive,NK1R-ir)阳性神经元,可以严重干扰正常的呼吸节律,并导致血气的异常,因此,在本实验中,我们应用NK1R作为pre-B?tC的标志物来标记呼吸神经元。C1细胞群属于肾上腺素能神经元,是具有儿茶酚胺/谷氨酸(glutamate,Glu)双重表型的神经元,呈柱状分布在VLM,主要参与病理情况下的呼吸-交感压力敏感性调控及心血管的交感紧张性调控。去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)可以通过作用于突触后膜的α1肾上腺素能受体(adrenoreceptor,AR),影响呼吸活动。多巴胺-β-羟化酶(dopamine-β-hydroxylase,DβH)作为NE合成的关键酶,常用来反映ne的变化,dβh-ir阳性不仅可以确定ne能神经元的性质、分布,而且在一定程度上,可根据免疫阳性产物量的多少及染色深浅确定ne能神经元内dβh水平、ne能神经元的含量及其变化。因此,我们将dβh作为c1神经元的特异性标志物,探讨dβh-阳性的心血管相关c1神经元与nk1r标记的pre-b?tc呼吸神经元之间的突触表型,从形态学角度阐述c1神经元对呼吸的调控作用。方法我们在应用常规的包埋前免疫电镜染色方法时,标记的dβh-ir神经元不仅阳性胞体少,且突起纤细、稀疏,电镜观察效果较差。由于所用抗体相同,但在光镜和电镜下显示出免疫标记结果的明显差异性,考虑与大鼠脑干切片厚度及处理方式的不同影响了抗体的渗透能力有关。因此,我们用不同浓度的tritonx-100及不同液氮冻融次数处理各组切片,光镜和电镜下观察比较不同方法对大鼠vlmc1区儿茶酚胺能神经元dβh-ir标记结果的影响。在预实验的基础上,应用免疫荧光组织化学法免疫荧光双标记显示vlm的dβh-ir阳性神经元与nk1r标记的神经元是否存在共定位,并利用纳米金-银加强免疫电镜双标记方法显示二者在神经元中的分布及突触表型。结果预实验光镜下观察到dβh-ir产物分布于胞体和突起,清晰标记c1区神经元。不同组间dβh-ir神经元数量明显不同,其中以0.05%tritonx-100组最为明显,差异显著。电镜下结果显示dβh-ir阳性颗粒主要分布在神经元的胞体、树突及轴突末梢内,dβh-ir阳性轴突末梢与dβh-ir阳性或阴性的胞体或树突形成不对称性突触,部分形成密切接触。免疫荧光实验结果显示:dβh-ir阳性神经元主要位于nk1r-ir阳性神经元群的腹外侧,与部分nk1r-ir阳性神经元相互重叠并形成密切接触,二者之间的密切接触通常存在于dβh-ir阳性神经元突起与nk1r-ir阳性胞体和突起之间。免疫电镜下观察到:在pre-b?tc,dβh-ir阳性神经元的胞体、树突和轴突末梢内含有大量胶体金颗粒,以轴突末梢内分布最密集,末梢内可见小而清亮的球形囊泡与密集的金颗粒掺杂分布。nk1r-ir阳性产物主要分布在pre-b?tc神经元细胞胞膜、树突及细胞质内。在pre-b?tc,dβh-ir轴突末梢主要形成不对称性突触,偶可见具有局部环路特征的对称性突触。研究表明含有小而清亮球形囊泡的不对称性突触,代表兴奋性glu能神经递质的传递,对称性突触通常接受抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的调节。提示C1神经元主要以兴奋性Glu的传递为主,而突触抑制对控制呼吸节律起着非常重要的调节作用。电镜下观察到部分DβH-ir轴突末梢与NK1R-ir的神经元形成不对称性突触,特别是与小梭形NK1R-ir阳性神经元,即呼吸节律起搏神经元形成突触联系,表明呼吸节律的发生也接受儿茶酚胺能神经纤维的调节。形态学证据首次证明pre-B?tC区产生吸气节律的神经元能够接受儿茶酚胺兴奋性的突触传递。另外,NK1R-ir阳性突起还与DβH-ir阳性的胞体和树突间形成密切接触,但在电镜下这种密切接触并不是直接接触,二者之间被胞膜和树突膜相分隔,推测呼吸神经元与心血管神经元之间可能通过旁分泌等途径进行神经递质的传递。结论金颗粒标记的数量在Triton X-100组明显多于冻融组,与光镜观察结果相一致;在VLM的C1和pre-B?tC神经元之间的信息整合主要以不对称性突触为主,表现为对心脏呼吸功能的兴奋性驱动作用。