一个osamiR159的新靶标基因介导对水稻白叶枯病菌抗性的负调控研究

• 作 者: 郭萍
• 机 构: 中国科学院大学
• 出 处: 中国科学院大学
• 发表日期: 2014年期
• 关键词: 水稻病害 白叶枯病 原生质体 基因表达

水稻是世界最重要的粮食作物之一，水稻白叶枯病是一种严重影响水稻粮食的细菌性病害。防治白叶枯病主要通过栽培技术，化学防治，生物防治以及植物遗传操作等。其中利用植物本身的抗病基因培育抗病植株是最有效且环保的防治方法。以水稻和Xoo作为模式生物研究植物和病原细菌相互作用，不仅可以阐明植物抗细菌的分子机制，还能为防治水稻白枯叶病提供有效策略。MiRNA作为一种重要的基因表达调控分子，在植物抗病中起到重要作用。系统分析植物中参与这些应答过程的小RNA，并根据小RNA对应的靶标基因分析靶标基因参与的代谢途径，有利于阐明病原侵染及植物抗病反应过程中基因表达的分子机制。实验室前期的研究发现，Xoo PXO99菌株侵染24小时后，水稻osamiR159水平明显受到抑制，并且证明了osamiR159一个新靶标LRR-RLK基因（RIR）。　　本研究发现，在小苗期，与野生型相比，RIR转基因沉默水稻或RIR敲除突变体表现出对Xoo更强的抗病性，而过表达植株则与野生型没有差异;在抽穗期RIR过表达转基因水稻比野生型水稻更易感病，而RIR敲除的植株与野生型没有明显差异。Western blot检测表明，苗期RNAi植株RIR蛋白表达水平较低，而穗期过表达植株蛋白表达水平较高。RIR基因的缺失导致水稻叶片ROS反应增强及JA相关基因表达的变化。我们的实验结果表明，RIR是一个水稻基础免疫途径的抑制子。亚细胞定位实验表明RIR定位于细胞膜上，与预测结果一致;磷酸化实验证明RIR激酶结构域具有磷酸化和自磷酸化的活性。与转基因方法相比，基因瞬时表达系统在基因表达研究上具有快速便捷的特点。为检验水稻miRNA与靶标基因之间的调控关系，将miRNA基因与GFP/靶标序列融合基因（或GFP/靶标突变序列融合基因）构建在同一瞬时表达载体上，并转化水稻原生质体，通过观察含有GFP/靶标序列融合基因和GFP/靶标突变序列融合基因的载体之间的荧光强度差异，以及通过qRT-PCR方法检测靶标和非靶标mRNA水平差异来验证miRNA对靶标基因的调控。用osamiR156和osamiR397及其靶标序列对实验设计方法进行验证，荧光显微观察和qRT-PCR检测证明，osamiR156和osamiR397能降低相应靶标序列GFP融合基因的转录物水平和GFP荧光水平。此种水稻原生质体瞬时表达方法用于在体内进行大规模miRNA靶标基因检测。由于其他近缘单子叶植物很可能与水稻有近似的小RNA加工系统，因此对于其他单子叶植物miRNA功能研究也将有很好的应用前景。