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纳米技术是在小于100纳米的尺度下对材料和物体进行研究的技术。八十年代初期,纳德里安·西曼(Nadrian Seeman)首先提出了DNA纳米技术的概念。其关键是核酸链,通过碱基配对的高特异和可预测性实现设计的可控操作。DNA纳米技术分为两个领域:结构DNA纳米技术(Structural DNA nanotechnology)和动态DNA纳米技术(Dynamic DNA nanotechnology)。其中后者运用一种toehold介导的链置换反应(Toeholdmediated strand displacement)机制使双链和单链之间进行动态重组,形成更稳定的新双链并且释放出一条单链。Toehold是一个短的单链区域,作为链置换反应的动力,其通常由5-8个碱基组成。利用链置换原理设计了一系列包括逻辑电路、纳米机器人、链置换级联反应放大器等纳米设备,其强大的置换动力和可预测性使得动态DNA纳米技术有望用于分子电子学以及医疗等领域。在DNA生物传感器中,DNA被当作生物识别元件去识别靶标。在识别过程中,产生的微小变化可以通过信号转换元件转换成可测定的信号以及肉眼可观察到的图形,从而实现对待测靶标的痕量分析。常见的信号转换元件,如电化学、荧光,石英晶体微天平和场效应晶体管等,使DNA生物传感器得以繁荣发展。其中,电化学DNA生物传感器因成本低廉、易微型化、灵敏度高、抗干扰能力强等优势,在床旁检测、分子诊断等领域有极大的应用前景。本工作中,将动态DNA纳米技术与电化学生物传感器结合起来,围绕着如何提高信噪比、实现传感器的快速制备及靶标的一步检出等关键问题设计一系列基于DNA结构转换的检测平台。两种基于链置换反应的电化学生物传感器,一类是“信号关”(“Signal off”)模式,检测靶标前后信号变化由高到低,另一类是“信号开”(“Signal on”)模式,即靶标检测前后信号变化由低到高。本文开展的工作是关于基因检测方法学的研究,具体内容如下:第一章:基于toehold设计的半杂交双链探针构建“signaloff”电化学核酸传感器在“signaloff”模式中,结构转换类电化学dna传感器的灵敏度不高主要是因为电极表面的氧化还原标志物无法清除,遮掩了靶标产生的信号。为了解决这个问题,设计了一种半杂交的双链探针,由一条较长的巯基链和一条较短的信号链组成,类似一个带有切口的茎环。半杂交体可以提供驱动dna链置换反应的toehold。当检测靶标时,靶标与巯基链杂交形成新的完全互补的双链体,同时信号链被置换下来脱离电极表面。这个反应可以从根本上消除电极表面上的信号链在靶标响应后残留的背景电流,从而提高检测的灵敏度。这个新型的基于toehold的电化学dna传感器实现了低至0.2pm/l的检测限,比经典茎环探针构建的电化学检测平台的检测限低两个数量级。同时,双链探针中的toehold赋予链置换反应高的选择性以及与靶标结合的动力。此外,该传感器还能再生,重复使用,甚至还能在复杂的人血清中检测低浓度的靶标,体现出良好的抗干扰能力。综上所述,基于dna链置换反应构建的电化学传感平台具有高灵敏、高选择性等优点,显示了其比传统电化学dna传感器在床旁检测中更具有应用前景。第二章:基于dna链置换反应和酶催化放大技术构建的一步式高灵敏dna电化学传感器“signaloff”模式的电化学传感器检测靶标时,其信号变化率不超过100%,因此设计了另一种“signalon”模式的电化学传感器。首先,依旧是先将一条双链探针固定在电极表面,与前面不同的是,探针中巯基链的另一端是电活性分子,而另一条链是没有任何修饰的辅助链,只是为了提供一个toehold。当靶标存在时,该辅助链通过toehold与靶标杂交形成新的双链体脱离电极表面被释放到溶液中。另外,前一个设计还有一个不足之处是受1:1的响应限制,即每个靶标分子只能与一个捕获链杂交导致一个链置换事件的发生,这样就限制了其在实际应用中的检测范围。因此这里还引入了核酸外切酶Ⅲ催化的信号放大策略。由于新双链体的一端是平末端,因此会被溶液中的核酸外切酶识别并且特异的从3’平末端开始切割,直到辅助链被完全水解,靶标被释放参与下一个链置换反应。反应60分钟后,最终电极表面固定的大部分巯基链在盐离子的作用下回到其最原始的茎环结构,同时电活性分子被拉到电极表面进行快速的电子传递,产生一个很强的电学信号。信号的大小是依据亚甲基蓝距离电极表面的远近来判断的,实验证明距离越远信号越小,反之,则信号越大。这个1:N的靶循环策略达到了42 fM/L的检测限,比前一个无酶链置换电化学DNA传感器的检测限低1个数量级。此外,该策略显示对单碱基错配的高选择性,并且能够直接在人血清和细胞培养基中检测低浓度的靶标DNA。将链置换反应的高选择性、酶催化靶循环放大策略和一步结构转换读出信号的高效性整合到一个传感器中,相信这个集多个优势于一体的传感器能为基因检测提供新思路。