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胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA protein)是一类参与植物抗逆性应答的亲水蛋白。LEA蛋白不仅是非生物胁迫环境因素选择的靶位点，也是局部研究植物适应机制的目标基因之一，以前体外实验表明，LEA_4蛋白共有的N-端保守区域是形成一个两性分子α-helix的关键，且在干旱或冷冻条件下对酶的保护发挥重要作用。多变的C-末端区域的进化意义和细胞作用仍然很大程度上是未知的。所以克隆LEA基因明确其作用机制，对于利用转基因技术改良植物的抗逆性具有重要意义。 在LEA蛋白超级家族中，LEA_4组蛋白的特征是一个保守的N-端区域和一个结构上无序的C-端区域，且C-末端区域氨基酸残基的种类和长度是可变。本实验以蒺藜苜蓿R108和A17两种生态型为材料，利用RT-PCR，SDS-PAGE，和原核表达等技术，分析LEA_4基因的表达模式，LEA_4B蛋白的热稳定性和在大肠杆菌中过表达对宿主菌的保护效果，旨在了解多变的C-端区域在细胞体内对细胞的保护是否发挥作用。研究结果如下: 1.蒺藜苜蓿R108生态型的7号染色体上定位到3个串联排列的编码LEA_4B蛋白的LEA_4B基因，它们具有高度保守的N-端区域，长度不等和氨基酸组成不同的C-端区域。 2.在非生物胁迫和ABA诱导条件下，3个LEA_4B基因的转录模式，表明着它们响应于非生物胁迫和外源ABA诱导。 3.在SDS-PAGE电泳中显示，LEA_4B蛋白的表观分子量要高过理论分子量，且经沸水浴后，LEA_4B蛋白的含量并没有发现明显的减少。 4.在大肠杆菌过表达LEA_4蛋白能明显提升宿主菌对高盐、脱水、高温和冷冻的耐受性。然而，不同的LEA蛋白对宿主菌的生长和生存的保护程度是不同的。低于全长的突变体MtLEA3140仅仅包含一个保守的N-结构区域，对宿主菌的保护程度低于全长MtLEA3140-M。这些结果表明，在结构上多变的C-末端区域，在保护细胞免受各种非生物胁迫的损害方面起着作用。 LEA_5蛋白是一类疏水残基高于典型LEA蛋白的非同源蛋白。凡是疏水残基比例高于典型的LEA蛋白的LEA蛋白都包含在LEA_5家族中。本实验在蒺藜苜蓿R108幼苗中克隆到一个编码LEA_5蛋白的MtLEA5B基因，主要研究结果如下: 1.MtLEA5B基因定位于1号染色体，Pfam数据库检索表明编码产物属于LEA5B类蛋白，经疏水氨基酸残基预测MtLEA5B蛋白具有较高的亲水性。 2.LEA_5蛋白在煮沸条件下，可以形成不可溶的球状蛋白;但本实验中，发现MtLEA_5B蛋白经沸水孵育后，SDS-PAGE电泳显示目标蛋白并没有明显的减少，表明虽然有实验结果对特定LEA蛋白功能和机制进行阐述，但LEA_5蛋白是一类疏水残基高于典型LEA蛋白的非同源蛋白，这些结果并不具有普适性。 3.在大肠杆菌中过表达MtLEA5B蛋白，明显增强了大肠杆菌对温度胁迫的耐受性。