北京鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及主要生物学特性研究

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本研究从发病雏北京鸭中分离到一株病毒,通过蚀斑纯化、形态观察、生物学特性研究和部分基因序列分析等手段对其进行了深入鉴定。结果表明,该病毒的基因组核酸为双链RNA,它对氯仿、胰蛋白酶不敏感,不能凝集1%的鸡红细胞,Mg2+也不能提高该病毒对50℃高温处理的抵抗力。电镜负染观察可见该病毒呈球形,无囊膜,有双层衣壳,外衣壳直径约为70nm,核心直径约为40nm,疑似呼肠孤病毒。针对鸭源呼肠孤病毒保守基因设计引物,采用RT-PCR方法,从该病毒培养物中扩增出600bp左右的目的条带。测序结果表明它与中国番鸭呼肠孤病毒S12株的S2片段相似性达94%。综合以上鉴定结果,证明本研究分离到的病毒为禽呼肠孤病毒,将该病毒命名为DRV-GZ株。测定其毒价为ELD50=10-4.87/0.2mL,TCID50=10-6.76/0.05mL。 该毒株致病性研究发现:DRV-GZ株可引起9~11d鸭胚发生100%的死亡,死亡高峰出现在接种后4~5d。死亡胚体全身点状出血,胚尿囊液清亮。该病毒接种9~11d鸡胚后也能引起死亡,并产生如同鸭胚的病变。但用DRV-GZ株人工感染北京鸭、番鸭、麻鸭和鸡后,不能引起明显的临床症状,也不能致死实验动物。只能造成一些内脏器官不同程度的病变,包括肺脏淤血、出血,肝脏出现水泡病变和脾脏出血坏死(共性病变),肾脏淤血(见于北京鸭、麻鸭和鸡),肾小球和肾小管轻度肿胀,肾脏尿酸盐沉积,心肌肌间水肿(见于北京鸭)。 细胞感染性研究表明:DRV-GZ株可直接适应鸭胚成纤维细胞(DEF)、鸭胚肝细胞(DELi)绿猴肾细胞(Vero)、仓鼠肾细胞(BHK-21),并产生稳定细胞病变,经传代后可适应鸡胚成纤维细胞(CEF),但在猪肾细胞(PK-15)和Marc-145细胞上未见明显病变。 根据GenBank发表的禽呼肠孤病毒S2、S3、S4基因序列设计引物,通过RT-PCR方法成功获得了DRV-GZ株S2、S3、S4基因全长cDNA片段,序列分析结果表明,该毒株S2基因的ORF长1.25lbp,编码由417个氨基酸组成的σA蛋白,与中国番鸭呼肠孤病毒S12株的核苷酸序列相似性达94.8%,氨基酸序列相似性99.0%。S3基因的ORF长1,104bp,编码由368个氨基酸组成的σB蛋白,与美国火鸡呼肠孤病毒TX99株的核苷酸序列相似性为61.8%,与法国番鸭呼肠孤病毒89330株的氨基酸序列相似性为68.2%。S4基因的ORF长1.104bp,与番鸭呼肠孤病毒中国分离株C4株的核苷酸序列相似性达85.1%,氨基酸序列相似性为96.5%。本研究还应用SOPMA方法和DNAStar Protean软件综合分析了σA、σB、σNS蛋白二级结构、亲水性、表面特性、柔韧性和抗原指数,并对各个蛋白的B抗原表位进行了预测。结果表明σA蛋白的B细胞表位可能在32~37,56~61,82~85,107~116,128~141,202~207,239~246,256~260,274~280,312~317,381~391这些区域内或附近。σB蛋白的B细胞表位可能在62~86,117~123,141~163,179~186,270~275,287~289,343~345这些区域内或附近。σNS蛋白的B细胞表位可能在152~155,218~227,239~250,353~356这些区域内或附近。
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