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植物生长发育的许多过程都是由短命调节蛋白的选择性降解控制的。其中泛素/26S蛋白酶体降解途径是植物体生命过程最精细的调节机制之一。2004年诺贝尔化学奖桂冠由以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯共同分享,就是因为他们在泛素(ubiquitin)调控蛋白质降解机制的研究中做出了杰出的贡献。在泛素途径中,泛素用来标记需要降解的蛋白质,被标记的靶蛋白继而被26S蛋白酶体识别并降解掉。研究表明“无功能的蛋白质在细胞内积累”是逆境胁迫对生物细胞产生伤害的共同特性,及时处理这些“垃圾”蛋白成为生物适应逆境的重要方式。快速生长及逆境条件下泛素基因的表达明显增加,泛素/26S蛋白酶体途径降解短命调节蛋白及异常蛋白质的速度也明显增加。现已发现泛素普遍存在于所有真核生物中,但过量表达泛素基因在提高植物逆境适应性方面的工作还鲜见报道。本论文在克隆了小麦泛素基因的基础上,研究了小麦泛素基因表达对水分胁迫的反应;构建了泛素基因的正义和反义表达载体,转化烟草获得了过量表达泛素基因和反义抑制泛素基因表达的转基因烟草植株;对转基因植株的逆境适应能力进行了鉴定分析。研究发现小麦泛素基因Ta-Ub1和Ta-Ub2的表达均受到水分胁迫的调控;过量表达泛素基因提高了转基因植株的抗逆性;抑制泛素基因表达的转基因植株叶片出现程序化死亡表型,抗逆性减弱。主要结果如下:1、小麦泛素基因Ta-Ub1(注册号:AY862401)在水分胁迫条件下上调表达,用20%和30% PEG-6000模拟水分胁迫条件,发现随着水分胁迫的加剧表达量逐渐增加,30%PEG处理的小麦幼苗中基因表达量高于20%PEG处理。2、小麦泛素基因Ta-Ub2(注册号:AY297059)的表达同样对水分胁迫产生响应,中度水分胁迫(20%PEG-6000处理)诱导Ta-Ub2基因上调表达,但严重水分胁迫条件下(30%PEG处理)该基因的表达下降,甚至低于正常供水对照。3、构建了小麦泛素基因Ta-Ub2正义表达载体,转化烟草,半定量RT-PCR检测证明获得了过量表达小麦泛素基因的转基因烟草植株,且不同转基因系表达转基因mRNA的水平有差异;同时,克隆了烟草泛素基因Nt-Ub1(注册号:DQ830978),构建反义表达载体,转化烟草,经半定量RT-PCR检测,获得了不同表达水平的反义转化烟草植株。4、购买商业泛素蛋白抗体,免疫法检测正义和反义转基因烟草叶片中泛素蛋白丰度,结果表明无论是过量表达Ta-Ub2泛素基因(编码一个单体泛素)还是反义抑制泛素基因表达,均未对转基因植株体内泛素蛋白丰度产生明显影响,但转基因植株抗逆性检测表明,目的基因对转基因植株生长发育所产生的生物学响应却非常明显。表现在以下几个方面:(1)正常生长条件下,过量表达小麦Ta-Ub2泛素基因的转基因植株就比对照呈现更好的长势。(2)过量表达小麦Ta-Ub2泛素基因提高了转基因烟草抗旱、抗盐及抵抗低温胁迫的能力,表现在种子萌发加快、幼苗生长势加强、水分保持及光合能力加强等,对多种逆境的适应能力均提高;同时,过量表达小麦Ta-Ub2泛素基因还提高了转基因烟草抵抗综合逆境胁迫(如低温与干旱并存、低温与盐胁迫并存)的能力。(3)反义抑制烟草泛素基因表达使转基因植株叶片出现早衰、黄化、色素含量降低,出现坏死斑点等症状;同时,反义转基因植株抗旱及抗盐胁迫的能力降低,表现在逆境条件下幼苗萌发与生长势弱,叶片光合能力与水分保持能力减弱等。5、对正、反义转泛素基因烟草植株体内超氧阴离子自由基积累状况进行检测,发现反义抑制泛素基因表达使转基因植株体内积累的超氧阴离子比对照植株多,而过量表达泛素基因的转基因植株体内积累的超氧阴离子积累较少。推测活性氧自由基积累量不同可能是不同转基因植株抗逆性差异的原因之一,泛素途径与活性氧清除有关。植物在田间环境中所遭遇的往往不只是单一的逆境胁迫,而是几种逆境同时出现(即综合逆境)共同作用于植物,这种情况往往对植物造成致死性伤害。植物对多种胁迫同时存在的反应方式与对单一逆境胁迫之间既存在差异,又具有相同之处。提高植物对多种逆境的适应能力,特别是对多种胁迫并存的综合逆境的适应能力至关重要。本研究表明,过量表达泛素单体基因不仅提高了转基因烟草的抗旱性、抗盐和抗冷性,而且提高了转基因植株对综合逆境胁迫的抗性,这为提高植物的综合逆境适应能力,培育抵抗综合逆境胁迫的作物品种提供了新的思路和途径。