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一、研究背景和目的背景:我们在临床上可以经常见到由物理、化学等各种因素导致的皮肤缺损,较大面积的皮肤缺损通过自体修复很难完全愈合,即使愈合后也大多留有瘢痕或畸形,这会给患者的心理和社会经济地位带来不利影响。现在临床上最常用的修复皮肤缺损的方法是皮片移植,皮片移植有两大问题需要解决:皮源及皮片成活。皮片移植一般采用自体皮肤移植物,但大多数烧伤病人面临自体皮源不足的问题,组织工程皮肤(tissue engineered skin,TES)移植在解决皮源供应的问题上具有很大的应用前景,已经有越来越多的TES被构建,但感染仍是TES替代物移植是否存活的关键问题。纳米银(Ag NPs)是一种粒径微小、表面积大、活性大、熔点低的抗菌材料,由于其在耐药性、抗菌性、安全性及促进创面愈合等方面的优越性能在医学领域受到广泛的关注。纳米银的抗菌活性远远高于普通银离子制剂,是一种高效的抗菌材料,目前Ag NPs在临床及动物实验方面已广泛开展,不仅具有较为理想的抗菌效果,而且可促进创面愈合,减轻创面感染风险。如果在生物材料中添加Ag NPs,则可以抑制细菌生长,在一定程度上帮助解决TES移植成活问题。在组织工程方面,3D打印已全方位开展,为其提供强大的技术支持;在构建所需的组织或器官时,它可以应用生物“墨水”来定位和负载药物、细胞等物质,并一层一层地打印,保证构建体的精确性[1]。近年来生物三维打印技术的快速发展为制定组织支架材料提供了快速精准的方法,已有各种生物“墨水”,例如胶原、明胶、透明质酸等成功应用与3D打印。明胶及胶原作为最常用的天然高分子材料,良好的生物相容性是它们显著的优点,但它们在机械性能、降解速率方面的不足,导致其在组织工程皮肤应用方面有一定限制。通过在明胶含胺基侧链上添加甲基丙烯酰基可以获得GelMA(甲基丙烯酸酐化明胶),GelMA不仅具有良好的生物相容性和广泛可调的机械性能,而且具有快速凝胶机制,经蓝光光照后可迅速凝胶,能够形成交联紧密的聚合物,是构建人工真皮替代物的较理想的生物材料[2]。然而GelMA本身并不具有抗感染的生物活性,在体内外复杂的生物环境中极易受到污染物或微生物感染,从而使皮片移植失败。目的:利用3D打印技术构建抗菌功能性人工真皮替代物——Ag NPs-GelMA复合水凝胶。测定Ag NPs体外抗菌活性及细胞毒性,将GelMA水凝胶和Ag NPs-GelMA复合水凝胶对比,评估水凝胶的抗菌活性、物理性能、微观结构以及对细胞活性的影响等。二、方法首先体外测定纳米银抗菌活性及细胞毒性,确定其对细胞活性的影响。GelMA由浙江大学高分子系实验室提供,取代度为70%。应用挤出型三维打印机打印水凝胶,将Ag NPs-GelMA复合水凝胶和GelMA水凝胶对比,将FBs细胞悬液种植在水凝胶上,利用CCK-8测定OD值评估各组水凝胶上细胞的活性,进一步用光学显微镜观察成纤维细胞(FBs)的增殖状态;测定支架的物理特性、观察支架内部微观结构。体外测定纳米银及Ag NPs-GelMA复合水凝胶的抗菌作用。采用SPSS分析软件对数据进行统计分析。三、结果(1)纳米银具有优异的抗菌性能同时在浓度>10ppm时具有明显的细胞毒性作用。(2)在三维打印过程中GelMA水凝胶和Ag NPs-GelMA复合水凝胶均具有快速交联和良好的结构保真度等优点。(3)扫描电镜观察结果显示,三种水凝胶均具有合适的有利于营养物质输送和细胞增殖的孔隙大小。(4)CCK-8测定结果显示,GelMA水凝胶支架上的细胞具有良好的细胞活性。Ag NPs-GelMA复合水凝胶所含纳米银浓度在高达100ppm时才显现出现细胞毒性。(5)支架抗菌实验研究显示了Ag NPs-GelMA复合水凝胶的抗菌作用。四、结论1.纳米银在低浓度情况下便有很好的抗菌效果。纳米银浓度>10ppm时细胞毒性随浓度增高而增加。2.本实验运用3D打印机打印Ag NPs-GelMA真皮替代物。结果表明,Ag NPs-GelMA复合水凝胶具有抗菌性能的同时,在生物相容性、机械性能、凝胶化时间以及构建体保真度方面同样具备GelMA水凝胶的各种优点,在3D生物打印方面具有广泛的应用前景,在将来,有望作为抗菌功能性人工真皮替代物解决组织工程皮肤存活中的关键问题。