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研究背景：
周围神经损伤是临床常见损伤，具有高致残性，其早期、精确诊断有利于提高疗效，改善患者预后。MRI是周围神经病交首选的影像诊断方法。神经干细胞为神经系统损伤的功能重建及神经修复提供了一条新的途径，利用神经干细胞对中枢神经系统损伤及病变实行干细胞替代或转基因治疗已成为研究热点。在干细胞移植中，需要能够实时、活体水平、连续观察移植体内干细胞的分布、分化及转归的手段。近年来，基于MRI的细胞成像能在活体水平示踪移植受体内的干细胞，成为干细胞活体监测的较理想的手段。目前在周围神经损伤中，神经干细胞移植后进行MRI活体示踪的可行性还不明确。
研究目的：
1.探讨NSCs体外Gd—DTPA及荧光染料PKH26双标记的可行性及安全性。
2.在坐骨神经牵拉伤模型中，探讨MR活体示踪标记NSCs在损伤神经内的分布、迁移、转归情况及示踪的持久性。
3.探讨NSCs移植能否促进周围神经损伤的修复及其可能的机制。
材料方法：
1.NSCs培养及鉴定
健康新西兰大白兔孕兔剖宫取孕16-118d的胎兔，取脑，悬浮细胞培养法分离、培养、纯化NSCs，对NSCs行Nestin鉴定及诱导分化后NSE和GFAP鉴定。
2.NSCs体外双标记及安全性检测
以Effectene为载体，将红色荧光染料(PKH26)及临床标准型对比剂钆喷酸葡胺(Gd—DTPA)转入NSCs进行双标记。标记后荧光显微镜下观测细胞膜有无PKH26的红色荧光，电镜下观察细胞内有无高电子密度的Gd颗粒。MRI体外检测标记效率及标记持久性。台盼蓝拒染实验、MTT实验分别检测标记细胞的活力，增殖能力。标记NSCs进行Nestin鉴定及诱导分化后NSE和GFAP免疫荧光鉴定观察标记对细胞的生物学性状的影响。
3.NSCs周围神经损伤的局部移植及MR活体示踪
制作兔坐骨牵拉伤模型，48只兔，分为3组，在损伤后1w时分别移植106标记细胞(n＝16)、106未标记NSCs(n=16)、PBS(n=16)于损伤神经牵拉段的外膜下。每组其中9只，进行损伤前、损伤后1、2、3、4、6、8、10w系列MRI检查，测量牵拉神经损伤段、损伤近段及损伤远段T1、T2弛豫时间及直径，评价细胞移植的疗效，并观察损伤肢体的外观，进行坐骨神经功能评价及组织学检查。每组另7只动物在神经牵拉伤后1w时局部神经外膜下注射细胞后即刻、3、7、10、14d，进行系列MRI检查，动态观察移植细胞在神经内的分布及迁徙，并行组织学对照检查。
4.统计学分析
计量资料以均数±标准差(-x±s)表示。标记细胞、未标记细胞的台盼蓝拒染率、MTT值比较使用重复测量资料的方差分析，T1WI信号强度、T1弛豫时间之间的比较使用t检验。采用重复测量资料的方差分析模型中多元方差分析各组各段间的T1、T2值及神经直径有无差别。坐骨神经功能评价指标(踝下垂、展趾反射及Tarlov评分)做线图，观察随时间变化的趋势。统计学分析使用SPSS13.0软件，检验水准为P<0.05。
结果：
1.NSCs分离培养鉴定
NSCs培养呈神经球形态悬浮生长，免疫荧光鉴定Nestin阳性，分化后NSE和GFAP阳性。
2.NSCs体外双标记
双标记后，荧光镜下标记细胞膜呈红色荧光，PKH26标记率达100％。电镜下细胞内可见致密的高电子密度的颗粒即为Gd颗粒。标记NSCs在T1WI上信号明显增高，T1时间缩短，体外MRI能检测到的最低标记细胞数目为5x103个。肉眼可持久观察至第3代标记细胞。NSCs标记后台盼蓝拒染率、MTT吸光度值与未标记NSCs无统计学差异(F=0.005～0.172，P＝0.693～0.943)、(F=0～0.833，P=0.388～0.992)。标记NSCs的Nestin及诱导分化后NSE和GFAP免疫荧光鉴定阳性。
3.周围神经损伤NSCs移植的MRI检测
牵拉近段：PBS组、未标记NSCs组及标记NSCs移植组神经直径各时间点各组间无统计学差异(P＝0.059～1.000)。牵拉伤后1w标记NSCs组T1值、T2值低于未标记NSCs组及PBS组T1值、T2值，并且与PBS组T1值、T2值有统计学差异(P=0.036，0.033)。
牵拉段：标记NSCs组、未标记NSCs组与PBS组牵拉段直径在损伤后8w时有统计学差异(P＝0.020，0.033)，标记NSCs组与未标记NSCs组间无统计学差异(P=0.798)。牵拉伤后1w、2w标记NSCs组T1值与未标记NSCs组、PBS组T1值有统计学差异(P＝0.012～0.045)。牵拉伤后1w标记NSCs组T2值与未标记NSCs组T2值有统计学差异(P＝0.044)。牵拉伤后8w、10w标记NSCs组及未标记NSCs组T1值均比PBS组T1值低，且有统计学差异(P＝0.008～0.049)，标记NSCs组与未标记NSCs组两者间无统计学差异(P=0.827，0.810)。
牵拉远段：PBS组、未标记NSCs组及标记NSCs移植组神经直径各时间点各组间无统计学差异(P＝0.096～1.000)。牵拉伤后3w标记NSCs组及未标记NSCs组T1值均低于PBS组T1值(P=0.042、0.019)，标记NSCs组与未标记NSCs组无统计学差异(P＝0.694)。三组之间各时间点的T2值无统计学差异(P=0.111～0.973)。
4.外观、功能评价及病理改变
牵拉伤后，移植标记及未标记NSCs组外观、踝下垂、展趾反射、Tarlov评分均较移植PBS组恢复快且优。标记及未标记NSCs组，同PBS组相比，2w时各组间神经纤维变性、轴突溶解情况基本相同，6w时NSCs组可观察到较PBS组更多的雪旺细胞增生与神经纤维再生，神经纤维稀疏程度较之减轻。至10w时，与PBS组对比，再生的神经纤维髓鞘更均匀，髓鞘增厚更明显，神经纤维密度更高。
5.体内NSCs移植的MRI示踪
移植于神经外膜下的标记NSCs在移植的即刻表现为神经外膜下的T1WI线状高信号，移植后3d-10d线样高信号逐渐模糊呈小片状，范围较前增大，信号强度较前减低，移植后14d高信号已不再可见。荧光显微镜下可见标记的NSCs由最初的外膜下注射点位置逐渐向神经损伤区域深处扩散、迁移，向牵拉近段、远段迁移。
结论：
1.使用Gd—DTPA及PKH26成功对NSCs细胞进行双标记，可使之既能为荧光镜所检测，也能为MRI检测，且标记对细胞的生物学性状并无影响，是一种具有良好前景的干细胞示踪方法。
2.双标记的NSCs在活体上能成功为MRI示踪，示踪最长可达10天。
3.NSCs移植能促进周围神经损伤的修复，测量损伤神经T1及T2时间能反映损伤恢复过程。