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目的:近年来,随着妊娠早期流产率的不断增加,有关着床期和着床前期发育毒性也越来越受到人们的关注和探讨。有研究发现着床前期胚胎暴露于某些化学物,可诱发胎儿畸形或引起胚胎死亡等发育毒性,此发现对胚胎着床前期是实验致畸不敏感期这一传统的致畸理论提出质疑。而维生素A酸(RA)是近年来研究比较广泛的一种凋亡诱导剂和致畸因子,用RA处理的发育中的胚胎可出现面部、神经管和四肢等部位的多种畸形。本课题主要研究全反式维生素A酸(ATRA)诱导体外培养小鼠囊胚内细胞群(ICM)和滋养层(TE)细胞凋亡,而导致囊胚细胞总数、内细胞群和滋养层细胞数目的变化,以及由此引起的囊胚细胞中细胞因子TGF-β1蛋白和Fas蛋白表达的改变,并了解这两种细胞因子对着床前胚胎发育的作用。从而探讨ATRA对着床前期胚胎发育毒性作用,为其致畸机理提供实验依据。 方法:通过促超排卵,获取妊娠3.5d小鼠囊胚,随机分成三组,即对照组(空白)、实验1组(含1μmol/L的ATRA)和实验2组(含10μmol/L的ATRA),分别培养在含0、1μmol/L和10μmol/L的ATRA的M199培养基中,培养24h,然后再吸出囊胚。72个囊胚用荧光染料propidium iodide(PI)和Bisbenzimide(Hoechst 33258)双重染色,分别计数囊胚内细胞总数以及内细胞群和滋养层细胞数。75个囊胚固定干燥后,用带有荧光(FITC)标记的原位末端标记(TUNEL)检测法,并通过激光共聚焦扫描显微镜观察ATRA诱导囊胚细胞凋亡效应,记录荧光值并分析;其余囊胚用免疫组织化学S-P法,分别检测不同剂量组ATRA对小鼠囊胚TGF—β1蛋白和Fas蛋白表达的状况,利用HPIAS-1000图像分析系统测定TGF-β1蛋白和Fas蛋白在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。 结果:(1) 囊胚荧光染色:在激光共聚焦显微镜下,滋养层(TE)细胞核呈粉红色,内细胞群(ICM)细胞核呈蓝色,实验2组中细胞总数和滋养层细胞数比实验1组和对照组明显减少(p<0.01);以及内细胞群细胞数较实验1组和对照组减少(P<0.05):其中以滋养层细胞减少为主。但实验1组与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。(2) TUNEL法荧光标记检测囊胚细胞凋亡:通过激光共聚焦显微镜定