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背景和目的： 心肌纤维化（myocardial fibrosis) 是由于多种病理因素导致正常心肌组织中胶原纤维过度沉积，胶原浓度和胶原容积分数显著升高，各型胶原成分比例发生改变且排列紊乱为主要特征的疾病，是心梗（myocardial infarction) 等心血管疾病不断发展最终导致心衰（heart failure)的一个重要病理改变，是心肌重构的关键病理特征和重要形成原因，是心衰预后的重要指标。 肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFbs) 作为损伤修复以及各种纤维化反应的主要效应细胞，直接影响修复结果和纤维化的转归。与其他组织损伤修复类似，心梗后的损伤修复，在增殖期大量累积的心脏肌成纤维细胞（cardiac myofibroblasts，CMFs) 承担了修复的主要任务，并在瘢痕成熟期以凋亡的形式消失。最终稳定、具有一定机械强度、几乎“去细胞” 的瘢痕组织的形成意味着修复的完成。 CMFs的凋亡中止了修复进程，避免过度纤维化，CMFs凋亡调控的异常将导致各种病理改变。相对于其他组织器官（比如皮肤组织）的损伤修复过程，由于心肌细胞缺乏再生能力，心脏代偿能力有限以及心脏时刻进行舒缩的高强度活动等特征，决定了心梗后修复的复杂性，虽然纤维化瘢痕代替梗死组织，但CMFs常常不及时发生凋亡，而是持续存在于瘢痕组织中，甚至非梗死区，持续合成分泌远大于心肌修复需要的细胞外基质，细胞外基质的过度沉积，造成心肌结构、功能进一步损害。这些“拒绝凋亡” 的CMFs造成了心梗后“二次伤害” ，即心肌纤维化。这类MFbs的凋亡抵抗现象也发生于其他纤维化组织中，但其中机制仍然不明确。 血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ ) 是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)主要的效应分子，具有强大的促纤维化效应，同时对细胞生存也有广泛的调控作用。心梗后高浓度Angll可诱导心脏细胞（心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞）发生凋亡，促凋亡作用显著影响了纤维化的发展。对于同样的有害刺激，成纤维细胞 （fibroblasts，Fbs )表现出更强的抵抗或适应能力，甚至使用心肌细胞致死性强度的刺激对Fbs可产生促增值的效应。传统观点认为AngⅡ通过促进Fbs的表型转变、增殖、胞外基质分泌等发挥促纤维化反应，那么，AngⅡ是否可通过调节Fbs的生存影响纤维化发生发展进程？心梗损伤修复后CMFs “拒绝凋亡” 现象是否与AngⅡ有关，其机制又是什么？ 为了回答以上问题，我们分别建立新生SD大鼠来源及成人心室来源的CMFs体外凋亡模型，观察AngⅡ是否具有诱导CMFs产生凋亡抵抗的作用，并探讨可能存在的机制。同时，为了进一步验证CMFs凋亡抵抗是否是导致纤维化的原因之一，我们收集成人皮肤瘢痕组织标本（人心肌纤维化组织标本难以获取)，观察生理性瘢痕与病理性瘢痕(包括增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩）组织中MFbs的凋亡情况，为我们的假说提供整体组织的数据支持。 方法： 第1章 1.1.制定实验技术路线。 第2章 2.1.酶解法、差速贴壁法收集纯化新生SD大鼠CFbs。 2.2.间接免疫荧光标记法分别标记a-SMA、vimentin、desmin、DDR2、FSP1、VWF。 2.3. CFbs培养 1-12天，Western blotting分别检测第 0、2、4、6、8、10、12天时a-SMA的表达情况；间接免疫焚光标记法标记a-SMA，观察0、1、2、4、6、8、10、12天CFbs中a-SMA的表达及分布。 第3章 3.1.分别用TNF-a、CHX以及二者联合使用诱导CMFs凋亡，观察凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达水平，构建CMFs凋亡模型。 3.2. Western blotting检测AngⅡ刺激CMFs不同时间时p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-RSK1、t-RSK1、p-p38、t-p38、p-JNK、t-JNK、p-AKT、t-AKT的表达情况。 3.3. Western blotting检测 CMFs 中血管紧张素Ⅱ受体1( angiotension Ⅱ receptor 1，AT1)、血管紧张素Ⅱ受体2 (angiotension Ⅱ receptor 2 ，AT2 )的表达；RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳检测CMFs中ATJa、ATlb, AT2 mRNA的表达。 3.4.为了确定AT1、AT2、ERK1/2是否与AngⅡ抗凋亡作用有关，在 Angll干预CMFs凋亡模型的基础上，给予AT1抑制剂losartan、AT2抑制剂PD123319、ERK1/2特异拮抗剂U0126 (流式细胞术实验中使用PD98059)，观察对AngⅡ效应的影响。Western blotting分别检测各组目的蛋白 p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-RSK1、t-RSK1、cleaved caspase-3、P-actin的表达，Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测各组早期凋亡细胞率， TUNEL法检测各组晚期细胞率。 3.5.为了确定RSK1是否与AngⅡ抗凋亡作用有关，在 AngⅡ干预凋亡模型的基础上，利用siRSK1下调RSK1表达，观察对AngⅡ效应的影响。Western blotting分别检测各组目的蛋白p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-RSK1、t-RSK1、cleaved caspase-3、P-actin表达，Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测各组细胞早期凋亡率，TUNEL法检测各组细胞晚期凋亡率。 第4章 4.1.为了进一步验证AngⅡ抗凋亡作用及其机制，利用成人心室成纤维细胞（human cardiac fibroblasts-adult ventricle，HCFs-av) ，在AngⅡ干预凋亡模型的基础上，给予AT1抑制剂losartan、AT2抑制剂PD123319、ERK1/2特异拮抗剂U0126，观察对AngⅡ效应的影响。Western blotting分别检测各组目的蛋白p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-RSK1、t-RSK1、cleaved caspase-3、P-actin表达。 4.2.为了确定RSK1是否与AngⅡ抗凋亡作用有关，在AngⅡ干预凋亡模型的基础上，利用siRSK1下调RSK1表达，观察对AngⅡ效应的影响。Western blotting分别检测各组目的蛋白p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-RSK1、t-RSK1、cleaved caspase-3、P-actin表达。 第5章 5.1.为了进一步佐证MFbs凋亡抵抗是否是导致过度修复的原因之一，收集人皮肤瘢痕组织标本（临床心肌纤维化组织标本很难得到），观察生理性瘢痕与病理性瘢痕（过度修复）组织中MFbs的凋亡情况，为我们的假说提供整体组织的数据支持。间接免疫荧光标记法、TUNEL法分别检测生理性瘢痕、病理性瘢痕（增殖性瘢痕、瘢痕疙瘩）组织中a-SMA和晚期凋亡细胞的表达及分布；HE染色观察组织细胞及胶原分布情况。 结果： 第2章 2.1. 体外收集培养NRCFs，表达a-SMA、vimentin、DDR2、FSP1，不表达 desmin、VWF。 2.2.体外培养NRCFs 6天后，显著表达a-SMA。 第3章 3.1.联合使用TNF-a和CHX处理24 hr可明显诱导CMFs高表达cleaved caspase-3。 3.2. AngⅡ明显抑制 TNF-a/CHX诱导 CMFs高表达 cleaved caspase-3。 3.3. AngⅡ可快速激活ERK1/2、RSK1、p38、JNK，但AKT磷酸化水平未见明显改变。 3.4. AT1抑制剂 losartan、ERK1/2特异拮抗剂U0126 (或 PD98059) 抑制ERK1/2、RSK1的激活，并且部分抵消Ang Ⅱ抑制TNF-a/CHX诱导CMFs高表达cleaved caspase-3、早期凋亡率、晚期凋亡率的作用，AT2抑制剂PD123319对A n gⅡ的效应未见明显影响。 3.5. siRSK1下调RSK1、p-RSK1水平，同时部分抵消了AngⅡ抑制TNF-a/CHX诱导CMFs高表达cleaved caspase-3，早期凋亡率、晚期凋亡率的作用。 第4章 4.1. AT1抑制剂losartan、ERK1/2特异拮抗剂U0126抑制ERK1/2、RSK1的激活，并且部分抵消AngⅡ抑制TNF-a/CHX诱导HCFs-av高表达cleaved caspase-3的作用。 4.2. siRSK1下调RSK1、p-RSK1水平，同时部分抵消了AngⅡ抑制TNF-a/CHX诱导HCFs-av高表达 cleaved caspase-3 的作用。 第5章 5.1.生理性瘢痕表面积及体积较小，呈现扁平条形状，颜色灰白。瘢痕疙瘩明显高出皮肤，呈隆起半球形，颜色灰白带粉红色，皮肤以下组织呈类似半球形，手术切除组织呈类球形，组织块体积较大。 5.2.生理性瘢痕组织有少量MFbs (绿色荧光），血管周围有强绿色荧光信号，推测为血管平滑肌细胞；组织中细胞数量较少（蓝色荧光），TUNEL检测未见晚期凋亡细胞；HE染色显示，组织中细胞数量较少，胶原纤维排列紊乱。 增殖性瘢痕组织可见大量MFbs，血管周围有强绿色荧光信号，推测为血管平滑肌细胞；组织中有大量细胞存在，组织中可见少量晚期凋亡细胞；HE染色显示，组织中存在大量细胞，其中包括部分炎症细胞；胶原纤维排列紊乱。 瘢痕疙瘩组织中有较多MFbs，血管周围有强绿色荧光信号，推测为血管平滑肌细胞;组织中细胞数量较少（蓝色荧光），组织中未见晚期凋亡细胞；HE染色显示，组织中有一定数量细胞；胶原纤维排列紊乱。 结论： 血管紧张素Ⅱ通过AT1/ERK1/2/RSK1信号通路抑制TNF-a/CHX诱导的CMFs凋亡，这可能是心肌纤维化的机制之一。