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催产素(Oxytocin, OT)经典的生理作用是诱发子宫和乳腺小叶间平滑肌收缩。近年来,越来越多的研究表明OT及OT受体分布于人体整个消化道的各个部分,直接或间接控制平滑肌运动,因此我们推测,OT可能是一种胃肠激素或神经肽,调节消化道活动。胆囊收缩素(Cholecystokinin, CCK)既是一种经典的胃肠激素,又是一种神经肽,对消化道的功能具有广泛的调节作用。我们曾发现腹腔注射OT抑制大鼠胃及小肠运动,这种作用可能是通过促进CCK释放实现的,但OT促进CCK释放的部位和详细机制尚不清楚。我们最近的研究也发现,在整体情况下,静脉注射OT通过CCK抑制大鼠胃的运动,但OT对离体胃肌条却无此影响。因此我们推测,OT通过促进小肠粘膜或肠神经丛释放CCK,后者引起消化道运动的抑制。为了证实该假设,我们采用监测十二指肠肌条张力的方法,在离体水平研究了外源性OT对十二指肠运动的影响,并探讨了CCK和肠神经丛(enteric nervous system)在其中的作用；通过RT-PCR和ELISA技术检测了OT处理后十二指肠组织中CCK mRNA及其蛋白的表达,用免疫组织化学方法对十二指肠内的OTR和CCK进行定位。本课题将探明OT对十二指肠运动的调节作用及其机理,弄清CCK在其中所起的作用,从而为探明OT在消化道运动调节方面的生理意义提供实验依据。材料与方法离体肌条的制备和肌张力记录实验选用健康雄性Wistar大鼠,280-300 g,实验前禁食18 h,自由饮水。快速牺牲大鼠,迅速取出十二指肠(距离幽门1 cm),放置在充满柯氏液的培养皿中,持续供给含95%氧气和5%二氧化碳的混合气体。在培养皿中将十二指肠沿肠系膜方向剪开,展开平铺于培养皿中,用清洁图钉固定,并沿与纵行平滑肌纤维平行的方向取出十二指肠纵行肌肌条(10×4 mm)。将各个肌条分别安置于灌流肌槽中,每个灌流槽中均盛有5 ml 37℃Krebs液并持续供给95%O2和5%CO2混合气体。肌条的一端固定在肌槽底部的玻璃弯钩上,另一端连接张力换能器(JH-2B,北京航天医学工程研究所),肌肉张力信号在生物信号记录分析系统(ML136-生物信号放大器和ML785-POWERLAB八通道记录仪,悉尼ADinstrments公司)上记录及分析。肌条在1 g的前负荷下孵育至肌条自发收缩活动平稳后,加入不同浓度的OT,观察肌条张力的变化。肌条分别观察经atosiban (OT受体阻断剂),lorglumide(选择性CCK1受体阻断剂)和TTX(电压门控Na+通道阻断剂)预处理后加入OT,观察上述阻断剂是否影响OT对十二指肠纵行肌条运动的作用。RT-PCR如上牺牲大鼠后取出十二指肠肠段,OT孵育后在trizol内匀浆并提取RNA。按照反转录试剂盒的说明进行RNA反转录,扩增引物购自Invitrogen公司。ELISA分离并培养的十二指肠纵行肌-肌间神经丛标本(longitudinal muscle-myenteric plexus, LMMP)上的细胞,培养液中加入不同剂量OT孵育30 s后离心并取上清液。按CCK ELISA试剂盒(购自GBD公司)的说明进行CCK检测。免疫组织化学(1)标记OTR：新鲜十二指肠石蜡切片,3%H2O2灭活过氧化物酶活性,山羊抗OTR多克隆抗体(1：50)4℃过夜。PBS冲洗后二抗孵育,镜下显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。(2)标记CCK：新鲜十二指肠石蜡切片,3%H2O2灭活过氧化物酶活性,兔抗CCK多克隆抗体(1：150)4℃过夜。PBS冲洗三次后滴加山羊抗兔IgG抗体—HRP多聚体工作液室温孵育30 min, PBS冲洗3次DAB镜下显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。免疫荧光三标新鲜十二指肠石蜡切片,厚度为4μm,常规脱蜡,水化。枸橼酸盐抗原修复,5%正常驴血清封闭。同时滴加兔抗大鼠CCK多克隆抗体(1：150)、山羊抗大鼠OTR多克隆抗体(1：50)和小鼠抗大鼠NeuN单克隆抗体(1：50)。将切片置于湿盒内,4℃过夜。PBS冲洗3次,每次5 min。然后同时滴加标记RB-200标记的驴抗兔、FITC标记的驴抗山羊和CyTM5标记的驴抗小鼠的荧光二抗,室温孵育60 min。PBS冲洗3次,每次5 min。甘油缓冲液封片,荧光显微镜下观察结果,拍照。统计学处理在离体肌条实验中,以肌条平均张力为观察指标,加入OT前3 min的平均张力基础值,加入OT后不同时间段的平均张力为效应值,效应值与基础值的比值为统计指标R。所有数据均采用均数±标准误表示,采用单因素方差分析、t检验进行统计学处理,以P<0.05为显著性差异界值。实验结果：1.加入三种浓度的OT到浴槽中,其终浓度分别为10-7M,10-6M,10-5M,肌条的自发收缩活动受到抑制。以加入10-6M OT后对肌条的抑制作用最明显。加入三种浓度催产素后30 s R值分别降低到0.838±0.021(P<0.05.n=6),0.759±0.842(P<0.05,n=6)。1 min后肌条的自发收缩活动恢复。2.OT受体阻断剂atosiban(10-6 M)完全阻断了OT对十二指肠纵行肌条的抑制作用。Astosiban预处理10 min再加入OT 30 s和单独加入OT 30 s两组肌张力的R值分别为0.758±0.025和1.053±0.009,两者相比有显著差异(P<0.05,n=6)。3.电压依赖性Na+离子通道阻断剂TTX(10-5 M)完全阻断了OT对十二指肠纵行肌条的抑制作用。TTX预处理30 min加入OT 30 s与单独加入OT后30 s两组肌张力的R值分别是0.758±0.025和1.049±0.040(P<0.05,n=6)。4.选择性CCK1受体阻断剂lorglumide(3×10-6 M)孵育后,OT抑制十二指肠的作用被完全逆转。Lorglumide预处理15 min再加入OT 30 s和单独加入OT30s两组肌张力的R值分别是0.758±0.025和0.979±0.015(P<0.05,n=6)。5.OT处理后组织中CCK mRNA的总量没有发生明显变化。6.OT处理后神经细胞培养液中CCK蛋白的量明显增多。加入OT(10-6峋后30 s细胞培养液中CCK的浓度由加入OT前的10.856±0.248升至11.914±0.185(P<0.05,n=6)。Atosiban预处理10 min再加入OT 30 s,与单独加入OT 30 s,细胞培养液中CCK的浓度分别是13.530±0.217和12.438±0.263(P<0.05,n=6)。7.免疫组织化学实验发现,肌间神经丛的神经元上有OTR和CCK表达,免疫组织荧光三标实验结果显示,OTR和CCK共同表达于十二指肠肌间神经丛同一神经元上。结论1.OT通过肠神经丛上的OT受体抑制大鼠十二指肠的运动。2.OTR表达于十二指肠肌间神经丛中CCK能神经元。2.OT对十二指肠运动的抑制作用可能是通过促进肌间神经丛神经元释放CCK实现的。