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细胞自噬是高度保守的细胞生物学行为，其分子机制从酵母细胞到哺乳动物细胞十分相似。在自噬过程中，待降解的胞浆组分及细胞器被包裹在具有双层膜结构自噬小体（autophagy）中，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，实现胞内物质的降解，从而维持细胞自稳。阻断蛋白酶体降解途径后，提取肿痛细胞培养上清中含有双层膜结构的自噬小体，因其中含有残留的废蛋白（defective ribosome products，DRips），称之为DRibbles（DRipsin Blebs）。我们前期实验证明，DRibbles作为肿瘤抗原载体能被DC摄取并通过交叉提呈途径诱导T细胞应答，DRibbles是具有潜在价值的肿瘤疫苗载体。
近来研究发现，p62作为多种信号传导途径中的支架蛋白，能通过C末端泛素相关结构域（ubiquitin-associated domains，UBA）与泛素化靶蛋白结合，并通过LRS（LC3recognition sequence，LRS）结构域与LC3结合，然后由LC3介导将泛素化靶蛋白包裹入自噬小体，最后自噬小体与溶酶体融合完成蛋白的降解。因此，p62在两种蛋白降解途径（蛋白酶体降解途径和自噬降解途径）之间发挥着重要的桥梁作用。
本研究拟构建HBsAg、泛素-HBsAg以及p62真核表达质粒，并转染HepG2细胞，提取转染细胞的DRibbles并检测其中HBsAg含量，探讨过表达p62蛋白能否提高自噬小体中泛素化蛋白（HBsAg）的含量，为优化DRibbles肿瘤疫苗提供新的思路。
目的：
探讨过表达p62能否提高自噬小体中泛素化蛋白的水平
方法：
1.构建p6A-O”PB-UF-IPWS-HBsAg重组质粒和p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重组质粒；
2.采用脂质体法转染HepG2细胞，分3组：①p6A-O”PB-UF-IPWS-HBsAg重组质粒转染组；②p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重组质粒转染组；③p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg与pIRES2-EGFP-p62重组质粒共转染组。万珂、雷帕霉素和氯化铵处理转染细胞并制备细胞裂解液和DRibbles；
3.ELISA法检测各组细胞裂解液和DRibbles的HBsAg含量。
结果：
1.成功构建了p6A-O”PB-UF-IPWS-HBsAg和p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重组质粒；用以转染HepG2细胞，并获得稳定表达株；
2.采用万珂、雷帕霉素和氯化铵处理p6A-O”PB-UF-IPWS-Ub-HBsAg重组质粒转染细胞，裂解液和DRibbles中HBsAg含量均增高；
3.万珂、雷帕霉素和氯化铵处理Ub-HBsAg和p62重组质粒共转染HepG2细胞，检测发现DRibbles中HBsAg的含量明显提高，且高于药物处理的Ub-HBsAg重组质粒单独转染组。
结论：
1.成功构建HBsAg的真核表达载体，转染HepG2细胞后能有效表达HBsAg蛋白；
2.成功构建Ub-HBsAg的真核表达载体，转染HepG2细胞后仍然能检测到HBsAg；抑制转染细胞的蛋白酶体降解途径，HBsAg有所增高；Western Blot检测显示：Ub-HBsAg融合蛋白大部分被裂解为HBsAg，这可能是Ub-HBsAg融合蛋白未能成为“短寿蛋白”的主要原因，为下一步完善实验设计提供了依据；
3.当蛋白酶体降解途径被抑制时，过表达p62蛋白在一定程度上促进泛素化蛋白进入自噬小体，有利于将更多的泛素化蛋白募集到DRibbles中。