论文部分内容阅读
目的：构建survivin shRNA干扰质粒载体，用于转染人鼻咽癌细胞株CNE2，体内、体外观察suvivin shRNA表达载体对CNE2细胞survivin基因/蛋白表达、细胞凋亡、细胞增殖和放射敏感性的影响，从而为临床鼻咽癌的基因治疗奠定实验基础。
方法：①根据survivin的cDNA序列设计构建survivin shRNA重组质粒pGenesil-1-survivin及阴性对照重组质粒pGenesil-1-HK，经酶切和测序鉴定正确后，分别提取两重组质粒转染CNE2细胞；②实验分为空白对照CNE2细胞组（简称CNE）、阴性对照重组质粒pGenesil-1-HK组（简称HK）和survivin shRNA重组质粒pGenesil-1-survivin组（简称SURVIVIN），分别进行体内、外实验；③瞬时转染48h时，FCM检测细胞凋亡，RT-PCR测定survivin mRNA表达，以观察survivinshRNA表达载体瞬时转染CNE248h后对survivin基因表达的抑制作用；④G418筛选获得各重组质粒的稳定转染CNE2细胞，RT-PCR测定survivin mRNA表达，FCM和Western-blowing检测蛋白表达，MTT测定细胞增殖能力；克隆形成实验观察细胞放射敏感性；⑤将各组稳定转染CNE2细胞接种BALB/c nu/nu裸鼠，建立荷瘤裸鼠模型；通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量，免疫组化测定survivin蛋白表达等方法，研究survivin shRNA对人鼻咽癌CNE2细胞生长的抑制作用。
结果：①酶切和测序鉴定结果表明，成功构建survivin shRNA重质粒表达载体pGenesil-1-survivin和阴性对照质粒pGenesil-1-HK；②瞬时转染48h时，凋亡指数结果为：空白对照组（3.57±0.34）％；pGenesil-1-HK组（3.77±0.33）％；pGenesil-1-survivin组（6.33±0.37）％；pGenesil-1-survivin组的凋亡指数是空白对照组的1.78倍（P<0.05）；pGenesil-1-survivin组survivin mRNA表达的抑制率为63.53％，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），而阴性对照pGenesil-1-HK组与空白对照组间无明显差异（P>0.05）；③G418成功筛选出各重组质粒稳定转染的CNE2细胞，FCM测得各组稳定转染细胞百分率均达85％以上；稳定转染pGenesil-1-survivin组CNE2细胞survivin mRNA表达抑制率为64.55％，与空白对照组及阴性对照pGenesil-1-HK组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；FCM及Western-blotting检测survivin蛋白表达抑制率分别为50.29％和51.24％，两结果基本符合，且与空白对照组及阴性对照pGenesil-1-HK组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；④细胞增殖速度的比较表明，pGenesil-1-survivin组稳定转染细胞的增殖能力明显抑制；⑤克隆形成实验证实survivin shRNA表达载体pGenesil-1-survivin沉默survivin基因表达后，可提高人鼻咽癌CNE2细胞的放射敏感性；⑥pGenesil-1-survivin组移植瘤较空白对照组及阴性质粒pGenesil-1-HK组的平均成瘤时间延迟，平均瘤体积、重量明显下降（P<0.05），切片的免疫组化结果进一步证实pGenesil-1-survivin组survivin蛋白表达明显下调。
结论：成功构建survivin shRNA重组质粒pGenesil-1-survivin；pGenesil-1-survivin重组质粒能在体内、外干扰人鼻咽癌CNE2细胞survivin基因表达，抑制CNE2细胞增殖，提高CNE2细胞放射敏感性；5’-GGACCACCGCATCTCTACA-3’可作为人鼻咽癌CNE2细胞survivin基因的RNA干扰靶点。