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苦瓜为葫芦科苦瓜属植物,它不仅是我国及东南亚各国人民喜爱的传统蔬菜,也是一种重要的药用植物。花药培养是获得单倍体植株最有效的方法之一,对植物育种有着非常重要的意义。本试验对影响苦瓜花药培养的诸因素进行了较系统的研究,首次从苦瓜花药愈伤组织分化得到不定芽。另外,针对苦瓜花药培养易于产生愈伤组织而难以再生不定芽的问题,首次对苦瓜花药和愈伤组织的内源激素含量进行了研究。主要的研究结果如下:
(1)苦瓜小孢子发育时期与花蕾长度,花药颜色密切相关。应当以花蕾长度和花药颜色双重标准衡量小孢子的发育时期。小孢子处于单核后期时,绿脆纵横径最小,纵径为2.597 mm,横径为1.933 mm;其他三个品种花蕾纵径在4.024-4.213 mm,横径在1.998-2.050 mm。花药颜色为青白至微黄也是小孢子发育到单核后期的特征。
(2)4℃低温预处理对苦瓜花药愈伤组织诱导率的影响因品种而异,经冷处理后,长白诱导率下降,碧秀、大白和胖妞的诱导率都显著提高。总体而言,苦瓜花药冷处理时间不宜过长,超过4天会显著降低诱导率,其最适冷处理时间为1-2天。
(3)当MS培养基中2,4-D浓度为0.5 mg/L,6-BA浓度2.0 mg/L时,各品种的花药愈伤组织诱导率最高,其中碧秀苦瓜达到了79.42％。2,4-D浓度的变化对花药愈伤组织的诱导影响明显,低浓度的2,4-D(0.1 mg/L)与BA各水平组合,都不能很好地让苦瓜花药长出愈伤组织,2,4-D浓度过高又会造成愈伤组织膨大迅速,褐化死亡也加快。
(4)苦瓜花药愈伤组织的诱导率随蔗糖浓度升高而显著降低,较高浓度的蔗糖可以有效抑制花药壁等体细胞发生愈伤组织,为了保证花药诱导率的同时也保证愈伤组织来源,培养基中添加50 g/L蔗糖最为适宜。
(5)培养温度和光周期对苦瓜花药愈伤组织诱导有着重要影响。黑暗条件下比较容易产生愈伤组织,但是愈伤组织的质地很疏松,颜色发白;光照条件下产生愈伤组织比较慢,但质地致密,颜色绿。温度越高,花药愈伤组织诱导率越高,但质地更为疏松。25℃暗培养1周再转至光培养得到的诱导率最理想。
(6)诱导阶段得到的愈伤组织按照外观和质地大致可分为两类:一类为黄白色、疏松状愈伤组织;另一类呈黄绿色、光滑颗粒状。
(7)在TDZ0.5 mg/L和2,4-D0.1 mg/L的组合中添加三十烷醇2.0 mg/L,碧秀苦瓜部分黄绿色愈伤组织出现深绿色芽点并最终形成不定芽,这是首次在苦瓜花药培养中分化出不定芽。在激素组合为谷氨酰胺0.1 mg/L+TDZ0.5 mg/L+2,4-D0.1mg/L的培养基中,黄白色愈伤组织出现3 cm左右的竖状突起。在激素组合6-BA0.5mg/L+NAA1.0 mg/L中,长白苦瓜的部分黄绿色愈伤组织分化出了根。
(8)在本试验中,长白苦瓜分化出不定根33条,根尖细胞染色体观察表明,其中4条为单倍体根,单倍体分化率为12.12％,其余为混倍体,其中三倍体较多。
(9)应用高效液相色谱法(HPLC)研究了苦瓜外植体和愈伤组织内源激素含量,结果表明:苦瓜易于诱导愈伤组织与其内源IAA含量较高关系密切;高含量ZT对于不定芽的分化非常重要;高含量的GA3会抑制不定芽的发生,低水平的GA3/ZT值对于不定芽分化至关重要。