论文部分内容阅读
目的：新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst是药用紫草的主要来源和道地药材,其次生代谢化合物具有很高的药用和工业价值。本研究拟从新疆紫草的环境角度出发考察YE、 Ag、 Pb、 Cd、 Cr、低温和UV-C对新疆紫草次生代谢物产量的诱导作用,尤其考察具有生物活性的次生代谢物,如酚酸类化合物、紫草呋喃类化合物以及紫草素类化合物等生物合成量的作用规律,并从新疆紫草的遗传角度出发,构建新疆紫草次生代谢途径上关键酶基因PAL、 HMGR、 PGT过表达和RNA干扰载体,克隆并注释对次生代谢具有非常显著调控作用的AP2/ERF转录因子家族的基因,同时基于新疆紫草转录组对新疆紫草ERF亚族做系统的生物信息学分析,以期搭建新疆紫草次生代谢的环境和遗传研究平台,指导新疆紫草次生代谢物的生物合成。方法：①利用HPLC方法检测YE、 Ag、 Pb、 Cd、 Cr、 YE+Ag、 YE+Pb、 YE+Cd、 YE+Cr、4℃低温和UV-C诱导下新疆紫草次生代谢物含量,并考察其基于时间的变化。②克隆新疆紫草PAL、 HMGR、 PGT基因,通过GATEWAY技术,将目的基因的全长转入过表达载体pH7WG2D,并将目的基因的编码区片段转入RNA干扰载体pK7GWIWG2D。③以紫草Lithospermum eiythrorhizon AP2/ERF基因(ACX71873)作为探针,通过电子克隆技术从新疆紫草的本地EST序列数据库克隆得到一条AP2/ERF基因,并使用本地和在线生物信息学工具对此做注释。④以紫草L. erythrorhizon的ERF蛋白质序列(序列号261363612)为探针,检索新疆紫草转录组,结合NCBI数据库,分离新疆紫草ERF转录因子候选基因,并进行系统的注释、分子进化分析和表达分析。结果：①考察YE、 Ag、 Pb、 Cd、 Cr、YE+Ag、 YE+Pb、 YE+Cd、 YE+Cr这9种诱导子对新疆紫草红色系悬浮细胞次生代谢物总量影响,可以发现,单一重金属的作用较YE和YE添加组的作用明显,主要表现为促进作用,尤以24h最显著。其中Ag对新疆紫草次生代谢物产量的促进作用最大,而且在48h分别达到新疆紫草红色系悬浮细胞总酚酸、总紫草呋喃、总紫草素以及总次生代谢物的最大值,依次较同一时间对照组高172%、199.2%、289%和205%。整体而言,4℃低温会新疆紫草红色系悬浮细胞次生代谢物总含量的促进作用非常显著,但是整体上不会改变随时间的变化趋势,与对照组保持一致。12h、24h、48h、72h、168h分别比对照组紫草呋喃类化合物总含量高73%、64%、84%、83%和42%。但是低温诱导组的最大值出现在72h,对照组则在24h出现。考察不同时间的UV-C辐射对新疆紫草红色系愈伤组织细胞次生代谢物总含量的影响,可以发现,24h、48h、72h、168h时诱导组分别高出对照组的含量26.4%、23.4%、21.4%和17%,在12h诱导组的含量为对照组的64.2%,说明12h以后,诱导组的含量开始整体超过对照组。整体而言,UV-C诱导可以促进新疆紫草次生代谢物的产生和积累,尤以168h时5min的UV-C诱导最明显。在对新疆紫草白色系悬浮细胞和愈伤组织细胞的考察中,白色系只能检测到酚酸类化合物,本实验所涉及的诱导子不会诱导其合成紫草呋喃类化合物或紫草素类化合物,YE和重金属诱导子、低温和UV-C依次最大可以较对照组提高白色系总酚酸含量46.4%(168h,Cd)、84.8%(4℃,24h)和92.6%(48h,UV-CV-15min)。②从NCBI获得新疆紫草PAL、 HMGR、 PGT基因,使用Primer primer5分别设计了过表达和RNA干扰引物,和对应含CACC接头的引物,并以新疆紫草cDNA为模版PCR克隆得到过表达载体构建所需的全长基因(长度依次为2086bp、2013bp、1023bp)和RNA干扰所需的基因片段(长度依次为490bp、525bp、328bp)。 PCR产物经过纯化后连接在pGEM?-T EasyVector后使用高保真酶Phusion? High-fidelity做PCR,并将产物转入了GATEWAY载体构建技术的BP反应入门载体pENTRTM/SD/D-TOPO? Vector,在卡那霉素抗性筛选后将新疆紫草PAL、 HMGR、 PGT基因的全长转入过表达载体pH7WG2D,并将目的基因的编码区片段转入RNA干扰载体pK7GWIWG2D。此外本研究制备了根癌农杆菌EH105感受态细胞,以备后续研究使用。③应用电子克隆技术,以紫草AP2/ERF序列为探针,获得了新疆紫草的条1077bp AP2/ERF的序列,包含一个618bp的开放阅读框编码205个氨基酸,命名为AeAP2/ERF。该基因编码的蛋白质不稳定系数为63.24,可能是不稳定的酸性蛋白质；从ProtScale分析的结果来看,该蛋白具有明显的亲水性末端；TMpred软件预测结果显示该蛋白未形成跨膜螺旋区域,可能不具有跨膜转运信号；使用Psort在线软件对AeAP2/ERF蛋白进行亚细胞定位的结果显示新疆紫草AP2/ERF蛋白很可能定位于细胞核,概率为70%；采用SignaIP4.1Server,推测AeAP2/ERF基因所编码的蛋白可能不存在信号肽,为非分泌蛋白,该蛋白在细胞质中合成后,不进行蛋白转运；通过在线软件SOPMA和SWISS-MODEL对新疆紫草AP2/ERF蛋白分别进行二级和三级结构预测,结果均显示无规卷曲是AeAP2/ERF蛋白的最大量结构元件,α-螺旋和延抻链分散于整个蛋白质中；新疆紫草的系统发育分析结果表明AeAP2/ERF与紫草在进化上的距离最短,亲缘关系最近,其次是唇形科的丹参；新疆紫草AP2/ERF基因编码蛋白质的功能分析显示,该蛋白调控转录的机率为8.8%,转导信号的机率为7.1%,作为生长因子的机率为4.6%,其他功能的预测机率过低,说明其AeAP2/ERF蛋白质很可能具有调控转录和信号转导方面的功能。④本研究从新疆紫草转录组检索目的基因,筛选到了27个ERF转录因子,大小从281bp到2758bp,所编码的氨基酸数分布在78-390之间。基因结构分析结果显示,所有AeERF都只存在一个较长的外显子,外显子和非编码区长短不一,外显子的长度在234-1173bp之间,非编码区长度在5-1834之间。FPKM值呈正态分布趋势,表达量主要集中在1-100之间。pI值显示,27个蛋白整体呈弱酸性,不稳定系数显示,AeERFs整体是稳定蛋白。由于所有AeERFs的疏水性平均值均为负值,故均为亲水性蛋白质。本研究所涉及的AeERFs预测结果显示均无信号肽二级结构和三级结构预测结果一致：无规则卷曲主要结构单元,α螺旋、延伸链和β转角分散在整个蛋白中。新疆紫草ERFs蛋白做保守序列预测结果显示含有三个保守序列：Motif1、 Motif2和Motif3。 Motif1的保守序列为x[KR][KH][YF] RGVR[RQ]RPWGK[WFY][AV]AEIRDP; Motif2的保守序列为[RK]K[GR][AT]R[LV]WLGT[FY][ED]TAEEAA[LR]AYD[RK]AA[FLY][RK][LI][RK]GSKA[KL]L; Motif3的保守序列为NFPH[LE][VI]G。27个蛋白主要定位在细胞核、微体、溶酶体、线粒体基质和细胞膜上。此外对27个新疆紫草ERF和紫草ERF蛋白gi261363612构建系统发育树,通过5种进化树的比较,认为最大似然法是本研究最适合的构建进化树方法。系统发育结果与已知ERF家族的分类一致,18个蛋白属于ERF亚族,9个蛋白为CBF/DREB亚家族。结论：①在遗传信息未发生变化的情况下,从环境的角度出发,提供新疆紫草细胞培养体系或转基因植株更类似于其道地产区普遍的环境条件,即低温和高强度紫外辐射,可以促进新疆紫草的次生代谢,提高次生代谢化合物的产量。本研究搭建了基于新疆紫草环境因素的研究平台,首次关注了多因素多水平环境因素对新疆紫草次生代谢的影响,这对于新疆紫草次生代谢物生物合成的研究具有重要意义。②从遗传物质的角度出发,采用GATEWAY技术,构建新疆紫草次生代谢关键酶基因的过表达载体和RNAi载体,能够为相关转基因株系的构建搭建好平台。新疆紫草次生代谢关键酶基因过表达和RNA干扰载体的构建,是基于遗传物质的遗传研究平台的搭建,对于次生代谢途径上基因功能验证和功能基因的挖掘提供了极大的便利,同时也填补了新疆紫草在转基因领域研究的空白。③基于电子克隆技术和生物信息学的遗传研究平台的搭建,进行新疆紫草次生代谢物生物合成相关的AP2/ERF转录因子家族基因的克隆和系统的生物信息学分析,为克隆和研究新疆紫草次生代谢相关基因提供了更快捷的方法,相关生物信息学分析也是实验克隆的重要参考。④生物信息学研究是新疆紫草次生代谢化合物生物合成机理探索的必要内容,新疆紫草转录组数据的分析是揭示次生代谢分子机理的关键,同样是新疆紫次生代谢遗传研究平台搭建的一部分。基于转录组的生物信息学研究,可以获取更多有用的生物信息,而且更为快捷。本研究从本地转录组数据出发,结合公共数据库,分离出了一个调控次生代谢的转录因子家族,并对该家族做了较全面的生物信息学分析,起到了搭建基于生物信息学的遗传研究平台的作用,填补了新疆紫草等非模式植物在生物信息研究领域的空白。