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本研究主要以研究如何优化人和鼠多能干细胞的培养和建系方法为主要方向,围绕这一方向有针对性地提出了相关科学问题,具体内容包括以下四个方面。
(一)无动物源成分培养体系下建立人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)系的研究。人胚胎干细胞及其分化的细胞在临床上的应用需要从头建立不接触动物源成分的培养体系,降低免疫排斥,提高细胞移植的安全性。在本项研究中,我们配制了以商品化人血清、无动物源成分基础培养基和各种人源的添加剂为主要成分的无动物源成分完全培养基,并用含有人脐带血清的培养基建立了人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast cells,HFF cells)系作为饲养层细胞。我们的研究证明这种培养体系能够支持已建立的人胚胎干细胞系的生长。此外,应用这一培养体系我们成功地建立了三株人胚胎干细胞系。
(二)人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)建系体系的优化。目前人类iPS细胞的研究还处于起步阶段,所采用的供体细胞还仅仅局限在人包皮成纤维细胞、表皮细胞、毛囊细胞、黑色素细胞和脂肪干细胞等少数细胞类型。更为棘手的是,这些细胞被重编程为iPS细胞所需要的时间比较长(十六到三十五天),效率很低,这大大增加了在这个过程中细胞变异的风险。因此,如何找到一种理想的人类体细胞来源是科学家们重点关注的问题。在本研究中,我们第一次发现孕妇产前诊断的羊水细胞中一类特殊细胞能够在病毒介导的重编程因子感染下,高效快速地重编程为iPS细胞,重编程发生所需要的时间(六天)为目前人类iPS细胞相关报道中最短,减少了在这个过程中细胞发生变异的可能。这一发现为重编程的机制研究以及基于新型技术探讨重编程的研究提供了理想的细胞来源。
(三)小鼠诱导多能干细胞建系体系的优化。在小鼠iPS细胞研究中,小鼠胚胎成纤维细胞(mouSe embryonic fibroblast cells,MEF cells)、胎牛血清(fetalbovme serum,FBS)和白血病抑制因子(1eukemia inhibitory factor,LIF)组成了常规的培养体系。在本项研究中,我们应用人包皮成纤维细胞为饲养层细胞,结合不添加外源LlF的含血清培养基成功维持了小鼠胚胎干细胞系的生长,并建立了一株新的小鼠胚胎干细胞系。我们进一步的研究发现,应用这种培养体系,能够高效诱导小鼠成体神经干细胞彻底重编程为小鼠iPS细胞,符合各项国际公认的鉴定标准。另外,研究提示,我们所建立的培养体系可能不通过经典的LIF/Stat3信号通路维持小鼠胚胎干细胞和iPS细胞的自我更新和多能性。
(四)大鼠胚胎干细胞样细胞系的建立。在以往的研究中,人和小鼠的胚胎干细胞已经被广泛的建立和使用,但是对于大鼠这个物种来说,胚胎干细胞的建系还不成熟,因此成为全世界关注的热点。在本项研究中,我们首先确定了大鼠囊胚期多能细胞的定位,然后通过改造和优化培养基配方,利用低血清的小鼠胚胎干细胞培养基,并添加了LIF和在小鼠胚胎干细胞建系过程中能有效阻止原始内胚层分化的化合物GSK3β的抑制剂BIO(6-bromoindirubin3-oxime),获得了大鼠胚胎干细胞样细胞系(rat ES-like cell line)。所建立的细胞系符合除嵌合体外的其它所有鉴定标准。