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背景及目的创伤后应激障碍(PTSD)是指个体经历异乎寻常突发威胁性或灾难性创伤应激事件,导致延迟出现及慢性持续存在的生理、心理障碍。PTSD主要表现为病理性重现,即持续重复体验创伤事件的经历、高度的警觉性、反应麻木与情感淡漠及逃避回忆等特征性症候群。PTSD病程慢性延续,严重影响患者的心理社会功能及生活质量。因时代特点突发应激事件高发,特别是官兵面临现代高技术战争挑战的新形势下,PTSD的发病率呈日渐增加趋势。PTSD伴发病、共病多且难治。PTSD与疼痛发生及痛觉敏化/去敏化的形成有密切的关系。PTSD样应激状态下内脏痛觉敏化/去敏感化关联疾病,如PTSD后肠易激综合征(IBS)、膀胱疼痛综合征的发生率呈上升趋势。PTSD样应激可能是IBS内脏痛敏触发、加重的重要因素。既往有关PTSD样应激状态下痛觉敏化/去敏感的研究主要聚焦于大脑的下丘脑、海马、杏仁核、内侧前额叶皮质和前扣带等,但目前以单纯的下丘脑-垂体-肾上腺轴应激理论为靶点开发的药物疗效欠佳。为此,寻找新的有效的治疗靶点有十分重要的价值。新近有研究提示脊髓及背根神经节(DRG)在应激相关的内脏痛觉敏化/去敏化的形成和维持中亦发挥了重要作用,且应激状态下脊髓中枢水平敏化和外周DRG水平敏化的研究逐渐成该研究领域的热点。迄今为止,尚不清楚PTSD样应激状态下内脏敏感改变-痛觉敏化/去敏感的确切分子机制及防治措施。嘌呤核苷酸P2受体亚型3(P2X3)高度选择性地表达于中、小直径DRG神经元中,蛋白激酶Cγ亚型(PKCγ)主要分布于脊髓背的Ⅱ层内侧部及Ⅲ层的交界处。诸多研究证实,PKCγ/P2X3在DRG和脊髓水平介导了疼痛信号的传导及其痛觉敏化的过程。PKCγ在静息时无活性,当受到外界刺激后神经元内Ca2+浓度增加,PKC发生转位而被激活；而PKCγ的激活引起通道电容的改变、多种兴奋性神经递质的释放、疼痛相关受体激活的级联放大效应。既往采用神经病理性痛、炎症性、癌性痛等研究发现,脊髓背角PKCy的表达明显升高,鞘内给予PKC特异性阻断剂GF109203X可逆转痛觉敏化现象,而在PKCγ基因敲除小鼠未观察到痛觉敏化的发生。既往亦发现P2X3参与了多种痛觉敏化／去敏化的发生,如在神经痛、炎性痛、骨癌痛大鼠模型DRG神经元P2X3表达明显增加,其介导的ATP激活的门控通道电流显著增强；应用P2X3受体激动剂α,β-me ATP可诱导痛觉敏化,而P2X3受体特异性阻断剂]TNP-ATP可逆转痛觉敏化,基因敲除鼠的P2X3受体其痛觉反应性降低。另有研究证实,PKCγ/P2X3之间存在相互作用,共同调控痛觉敏化/去敏化的形成。P2X3受体的结构上N末端与PKC结合后,可导致PKC磷酸化；改变P2X3受体上的PKC结合位点或采用PKC抑制剂阻断其作用后,可减少α,β-me ATP诱发的P2X3受体内向电流；PKC的活化可使DRG上α,β-me ATP诱发的P2X3受体电流增加。根据上述理论基础,我们推测：PKCγ/P2X3介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用及机制。旨在为PTSD样应激状态下痛觉敏化/去敏化的临床防治提供新的思路,希望对各种应激事件后PTSD痛觉敏感性改变相关疾病的有效干预提供重要的理论依据。方法1. 选用健康成年SD雌性大鼠,采用连续单一应激(SPS)联合足底电击建立PTSD样应激状态下内脏敏感性改变的动物模型；2.采用结直肠扩张(CRD)-VMR和AWR评估正常对照组、PTSD术后1、6、7、9、14、21、28、29天时内脏敏感性改变/痛行为学变化；3.采用免疫荧光漂染技术联合激光共聚焦显微技术、Western blot技术研究DRG中P2X3及脊髓背角PKCγ表达水平的动态变化；4.采用鞘内注射PKCγ阻断剂GF109203X和P2X3受体阻断剂NP-ATP方法,观察GF109203X和TNP-ATP分别对PTSD大鼠内脏敏感性／痛行为学的影响；5.采用全细胞膜片钳技术研究PTSD样应激状态下DRG神经元上P2X3受体电生理特性的改变,及TNP-ATP的抑制作用。结果第一部分PTSD样应激状态下VMR和AWR的动态变化采用CRD-VMR和AWR评估正常对照组、PTSD术后1、6、7、9、14、21、28、29天时内脏敏感性改变。在40、60mmHg压力下行CRD时PTSD术后1天组其曲线下面积(AUCVMR)值和AWR值明显低于正常对照组,PTSD术后6天组AUCVMR值和AWR值逐渐恢复至正常水平。然而在PTSD术后7天组,在40、60mmHg压力下时AUCVMR值和AWR值明显升高,并且持续到PTSD术后28天,在PTSD术后9天时AUCVMR值和AWR值达到高峰。在PTSD术后29天组其A.UCVMR值和AWR值恢复至正常。第二部分 PKCγ在脊髓中枢水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制1.PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达的动态变化采用免疫荧光漂染/激光共聚焦显微技术/Western blot技术研究发现：PKCγ阳性产物主要分布于脊髓背角Ⅱ、Ⅲ层。PTSD术后1天组的大鼠PKCγ蛋白的平均荧光强度值(AOD)和、Vestern blot的相对光密度值(ROD)低于正常对照组,PTSD术后6天时表达水平与正常对照组无差异。在PTSD术后7天开始明显升高,第9天时到高峰,且一直持续至28天,差异有统计学意义。其后在PTSD术后29天PKCγ表达开始降低。2.在PTSD样应激状态下鞘内注射不同浓度梯度的PKCγ阻断剂GF109203X对内脏敏感性/痛行为学的影响PKCγ的表达在PTSD术后9天时达到高峰,故选择在PTSD术后9天行鞘内注射PKCγ特异性阻断剂GF109203X,观察不同浓度梯度的GF109203 X对大鼠内脏敏感性/痛行为学的影响。结果显示,在PTSD术后9天时鞘内注射低浓度的GF109203X(0.05-0.15 nmol/10 μL)时,其AUCVMRAWR的值与空白对照组没有显著差别。鞘内注射0.30nmol/10 μL浓度的GF109203X在40mmHg水平压力下行CRD时其AUCVMR值和AWR的值降低,但在60mmHg水平压力下其AUCVMR值和AWR的值与空白对照组没有显著差异。然而鞘内注射0.50nmol/10μ L浓度的GF109203X在40、60mmHg水平压力下行CRD时其AUCVMR值和AWR的值均呈现显著降低,在PTSD术后7、14、21、28天分别鞘内注射0.50 nmol/10 μL浓度的GF109203X可以观察到其AUCVMR 和 AWR的值与空白对照组比较明显降低,这表明GF109203X在0.50nmol/10 μL的浓度时可完全抑制PTSD样应激状态下的内脏高敏感现象。第三部分 P2X3在外周水平介导PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制1.PTSD样应激状态下DRG上P2X3表达的动态变化P2X3高度选择性地表达于与伤害性感受和痛觉有关的中、小直径DRG神经元中。我们对正常对照组,PTSD术后1、6、7、14、21天组大鼠的DRG行免疫荧光染色发现：PTSD术后1天组的大鼠P2X3的AOD值低于正常对照组,PTSD术后6天时表达水平与正常对照组无差异。在PTSD术后7、14和21天时与正常对照组比较均明显升高差异有统计学意义,其中在PTSD术后第7天时达到高峰。2. PTSD样应激状态下P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP对内脏敏感性/痛行为学的影响因为前面实验提示P2X3的表达在PTSD术后7天时达到高峰,故选择在PTSD术后7天行鞘内注射TNP-ATP。在PTSD术后7天行CRD扩张前10分钟时,鞘内注射TNP-ATP其AUCVMR值和AWR值在40 mmHg和60 mmHg可显著降低,与PTSD术后7天对照组比较。3.在PTSD样应激状态下大鼠DRG上P2X3受体电生理特性的变化,α,β-me ATP诱发的P2X3内向电流的改变及P2X3受体特异性阻断剂TNP-ATP的抑制作用α,β-me ATP作用于大鼠DRG神经元后可引起α,β-me ATP的内向电流。与正常对照组比较,PTSD术后7天组,α,β-me ATP可使DRG神经元P2X3受体介导的内向电流幅度明显增强,而选择性P2X3受体拮抗剂]TNP-ATP可完全抑制其诱发的内向电流,经5分钟洗脱后TNP-ATP的阻断可完全恢复。结论1.采用SPS联合足底电击的方法成功建立了PTSD内脏敏感性改变-痛觉敏化/去敏化的动物模型；PTSD样应激状态下内脏敏感性/痛行为学的发生了动态变化,PTSD样应激对VMR和AWR有明显的影响；2. PKCy在脊髓中枢水平介导了PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制,PTSD样应激状态下脊髓背角PKCγ表达发生了动态变化,鞘内注射PKCy阻断剂GF109203X可抑制PTSD内脏高敏感性形成,并发挥抗内脏伤害性刺激的镇痛效应；3.P2X3在外周DRG水平介导了PTSD样应激状态下内脏敏感性改变—痛觉敏化/去敏化的作用机制；PTSD样应激状态下DRG上P2X3表达发生了动态变化,P2X3受体特异性阻断齐TNP-ATP减轻内脏敏感性／痛行为学反应；在PTSD样应激状态下大鼠DRG上P2X3受体电生理特性的发生了变化。