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肿瘤坏死因子配体6(TNFSF6)是肿瘤坏死因子配体家族的一员,对于维持机体的免疫稳态至关重要,它能够通过与其受体TNFRSF6结合后致使靶细胞程序性死亡,然而目前对鱼类TNFSF6的研究相对匮乏。为了研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)TNFSF6(Tro TNFSF6)的抗菌免疫相关功能,本研究克隆并鉴定了卵形鲳鲹Tro TNFSF6,并对其抗菌活性进行了初步研究。结果如下:(1)Tro TNFSF6的开放阅读框序列长度为687 bp,编码228个氨基酸,预测的蛋白大小为25.5 k Da。Tro TNFSF6包含一个跨膜区和一个TNF家族特有的结构域,并且含有两个能够形成二硫键的半胱氨酸残基,一个潜在的N-糖基化位点和一个酪氨酸磷酸化位点。序列同源性比对的结果显示,TNFSF6的保守性较低,Tro TNFSF6与其他硬骨鱼TNFSF6的同源性为25.64%～58.79%,其中与棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)的TNFSF6的同源性最高,为58.79%,与大西洋鳕(Gadus morhua)TNFSF6的同源性最低,为25.64%。系统进化树显示,Tro TNFSF6与同为鲈形目的棘头梅童鱼、斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)聚为一支,其亲缘关系最近,而与人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的亲缘关系最远。(2)组织特异性分析表明,Tro TNFSF6在检测的11个组织中均有表达,且在肝脏中的表达量最高,其次是肠道和鳃,而在肌肉中表达最低。此外,卵形鲳鲹在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激后,肝脏、脾脏、头肾中Tro TNFSF6的表达量均显著上调,且在感染24 h时,肝脏和头肾中的表达量到达峰值,分别上调了84倍与33.8倍,脾脏中Tro TNFSF6表达量的峰值在感染12 h时出现,表达量最高上调5.5倍。(3)于细胞膜表面表达的TNFSF6能够与其受体TNFRSF6相结合,触发系列生物学功能,细胞定位显示,Tro TNFSF6定位于卵形鲳鲹吻细胞(GPS)的细胞膜上。为分析Tro TNFSF6在鱼体内发挥的功能,本研究构建了Tro TNFSF6的过量表达质粒,并从个体水平进行了分析,结果发现,当Tro TNFSF6在鱼体内过量表达后,其血清中的碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性显著性提高。为研究Tro TNFSF6的体外活性,本研究构建了Tro TNFSF6的原核重组表达质粒并获得其蛋白r Tro TNFSF6,研究结果表明r Tro TNFSF6能够显著诱导卵形鲳鲹淋巴细胞的增殖,并且呈现一定的剂量依赖性。为了检测r Tro TNFSF6在癌细胞增殖中的作用,我们向小鼠肝癌细胞Hepa1-6中加入r Tro TNFSF6进行孵育,并用流式细胞仪检测细胞的凋亡水平,结果发现加入r Tro TNFSF6的Hepa1-6细胞,其凋亡率相比对照组显著上升了14.05%;当对Hepa1-6细胞中TNFSF6蛋白进行干扰表达后,相比对照组其凋亡率显著降低了13.44%,结果表明Tro TNFSF6能够促进小鼠肝癌细胞的凋亡。综上所述,Tro TNFSF6在卵形鲳鲹抗细菌免疫过程中扮演重要的角色,并且能够促进Hepa1-6细胞发生凋亡,本实验的研究结果将为今后对TNFSF6的深入研究与对卵形鲳鲹免疫机理的挖掘提供便利。