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桔梗(Platycodon grandif1orum(Jacq.)A.DC),是一种我国传统的中草药,具有药食兼用特点。据《神农本草经》记载,桔梗传统药性平,归肺经,味苦,辛。具有润肺利咽,止咳祛痰等传统功效。桔梗中含有三萜皂苷、多糖类、黄酮类等化学成分。其中的桔梗皂苷(Saponins from Platycodon grandiflorum saponins,PGS)是桔梗最主要的活性成分,也是其特征性成分。经现代药理学研究表明,桔梗皂苷除具有生津润咳,补脾益肺等传统作用功效外,还具有抗炎、抗肥胖、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化及肝保护等丰富的药理活性。桔梗皂苷D(platycodon D,PD)是PGS中含量较高一种成分,也是桔梗三萜皂苷中含量较高的特征性成分,是桔梗药材及制品质量控制的指标性成分,具有丰富的药理活性。本研究基于PI3K/Akt信号通路分别建立顺铂(cisplatin,CDDP)诱导小鼠急性肾损伤体内模型和CDDP致人胚肾细胞(HEK-293)肾毒性的体外模型两部分深入探讨了PGS和PD的肾保护作用,并揭示其可能的分子机制。1.PGS对CDDP诱导小鼠急性肾损伤的改善作用。将小鼠随机分成4组(每组8只):空白组、模型组(CDDP,25mg/kg)、CDDP+PGS低剂量组(15mg/kg)、CDDP+PGS高剂量组(30mg/kg)。采用灌胃方式预给药10天,第7天给药1h后,一次性腹腔注射CDDP(25mg/kg)造成急性肾毒性。实验结果表明:CDDP模型组小鼠肾脏指数以及血清中的血尿素氮(BUN)和血肌酐(CRE)水平显著增加。组织病理学H&E染色观察到模型组小鼠肾组织出现大量的炎性浸润和坏死细胞,PGS给药10天后上述症状能够得到明显缓解。免疫组织化学染色及western blot检测结果表明:PGS能够有效抑制CDDP给药后凋亡相关的Bcl-2家族以及Caspase家族等蛋白表达。同时,TUNEL染色的结果佐证了PGS可以明显地抑制CDDP引起的肾细胞的死亡。此外,同样测定了肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β)、氧化酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及核因子(NF-κB)通路相关蛋白,PGS可以明显改善CDDP导致的这些炎症因子的过量表达,表明PGS能够显著缓解小鼠体内的炎症反应。最后采用western blot方法从蛋白水平检测上游的PI3K/Akt靶点,结果表明PGS能够显著逆转CDDP诱导的PI3K/Akt相关蛋白表达的降低。总之,PGS可能通过抑制NF-κB通路的活化以及调节PI3K/Akt介导的凋亡通路来发挥对顺铂导致急性肾毒性的保护作用。2.PD对CDDP致HEK-293肾毒性的保护作用。基于PGS对顺铂致小鼠肾损伤的体内实验结果,通过建立CDDP致HEK-293肾毒性的体外模型来进一步阐释PD的肾保护作用及其作用机制。实验结果表明:通过时间依赖性以及给药浓度依赖性的实验,最终确定给药和造模时间以及给药浓度。CDDP造模后细胞匀浆中MDA浓度明显升高、GSH显著降低,PD处理后的细胞大大改善。同时,ROS荧光染色结果进一步佐证了PD能够有效缓解CDDP导致的氧化应激。ELISA测定了细胞中TNF-α和IL-1β炎症因子的水平,western blot分析检测了细胞中NF-κB通路相关蛋白,表明了PD能够显著抑制CDDP诱导的炎症反应。此外,Hoechst 33258染色观察到CDDP模型组致密浓染,western blot分析的Bcl-2家族和Caspase-3家族等凋亡相关蛋白发现CDDP处理使促凋亡蛋白显著升高、抗凋亡蛋白显著降低,PD预给药能够明显改善,表明PD有效抑制CDDP诱导的细胞凋亡。最后,利用western blot的方法测定PI3K/Akt这一上游信号通路,进一步用PI3K抑制剂LY294002联合给药,说明PI3K/Akt通路参与到PD抑制CDDP导致的肾毒性的作用。总之,PD可以通过调节NF-κB和PI3K/Akt信号通路,抑制CDDP诱导的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等途径而起到保护作用。综上所述,本研究结果充分表明,桔梗总皂苷及桔梗皂苷D能够有效调节PI3K/Akt信号通路及其介导的NF-κB信号通路,缓解CDDP引起的氧化应激损伤,抑制炎症反应和细胞凋亡等途径,从而明显改善CDDP诱导的急性肾毒性。为临床上治疗CDDP肾损伤及其相关保健药物的开发提供理论依据。