论文部分内容阅读
前言:宫颈癌是全世界妇女中第四大最常见的癌症,在妇女癌症死亡率中居第四位。宫颈癌的死亡原因最常见的是侵袭和远处转移,宫颈癌的侵袭和转移的发生是一个复杂的多因素参与的过程,目前关于其发生的机制尚不完全清楚。在肿瘤进展过程中多种肿瘤细胞通过形态和表型转换显示其可塑性发生变化,上皮间质转化(EMT)在胚胎发生、慢性炎症和纤维化以及癌症进展过程均扮演着重要的角色,EMT目前被广泛认为是恶性肿瘤进展的一个重要标志,在乳腺癌、肝癌、肺癌和结肠癌的进展中发挥着重要的作用。EMT发生的特点是上皮特性的丧失和间充质基因表达同时增高,主要表现为的上皮钙粘蛋白(E-cadherin)的下调甚至缺失,E-cadherin作为粘附连接的重要组成部分,通过与其胞外结构域结合,同时与邻近上皮细胞的E-cadherin分子结合,从而使细胞与细胞接触稳定。在细胞外基质中,E-cadherin与β-catenin、α-catenin和p 120-catenin结合,从而使细胞内的细胞接触稳定在β-catenin、α-catenin p 120-catenin之间,后者在细胞外信号转导和粘附连接与肌动蛋白细胞骨架的连接起着关键的作用。放化疗,作为复发和转移的宫颈癌的主要辅助治疗方式,对于预后未见明显改善,且增加了化疗的全身副反应及化疗耐药的发生。因此急需一种新的辅助药物治疗未控及转移宫颈癌,目前大量研究证实β-榄香烯(β-elemene)在多种恶性肿瘤中均有抗癌效果,比如乳腺癌,卵巢癌,肝癌,胰腺癌,但其作用机制目前尚不清楚。而且目前关于β-榄香烯在宫颈癌中的研究很少及其作用机制目前尚不清楚。此次研究中我们首先探讨了β-榄香烯对宫颈癌细胞的增殖,周期,凋亡及侵袭能力的影响,其次,利用为了研究β-榄香烯对于EMT的影响,我们通过TGF-β1刺激宫颈癌细胞后建立了宫颈癌EMT模型,进一步探讨β-榄香烯对于TGF-β1诱导的宫颈癌细胞的EMT的影响。Wnt/β-catenin信号通路由癌基因和抑癌基因编码的一系列蛋白组成,在胚胎发育、细胞内运输和细胞凋亡中起着重要作用,此外,恶性肿瘤的发生及进展也多伴有Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。在Wnt/β-catenin信号通路激活过程中,β-catenin本身不能与DNA直接结合,因此它必须与DNA相互作用。β-catenin表达增高,入核增加后与LEF/TCF结合,随后其下游参与肿瘤增殖及侵袭的基因被激活,最终导致肿瘤进展的发生。研究表明在喉癌中Sox 2过表达细胞的迁移和侵袭能力增强,这种改变与β-catenin的激活、EMT发生过程密切相关。此次研究中我们检测了β-榄香烯与Wnt/β-catenin信号通路的关系,为今后研究β榄香烯在宫颈癌的治疗方面提供理论依据。方法:第一部分:选择宫颈癌SiHa和HeLa细胞系,MTT法检测β-榄香烯对其增殖影响;流式细胞仪检测β-榄香烯对其周期和凋亡的影响;细胞划痕法和Transwell法检测β-榄香烯对其迁移及侵袭能力的影响;Westernblot检测β-榄香烯作用后Wnt/β-catenin相关通路蛋白的变化。第二部分:采用显微镜观察TGF-β1刺激宫颈癌细胞后的形态学变化并采用Western Blot检测EMT相关蛋白变化;采用MTT检测TGF-β1对于宫颈癌细胞的增殖能力的影响;划痕实验和Transwell实验检测TGF-β1对于其迁移及侵袭能力的影响。第三部分:采用Transwell实验检测β-榄香烯及TGF-β1对于宫颈癌细胞迁移及侵袭能力的影响;采用Western Blot检测Wnt/β-catenin及Sox2相关蛋白变化;采用免疫组化检测不同病理级别的宫颈癌组织中β-catenin、TCF7、Sox2的表达及相关性;采用核浆分离技术及Western Blot检测β-榄香烯对于TGF-β1引起细胞核中β-catenin变化的影响;采用免疫共沉淀实验检测β-榄香烯对于β-catenin及Sox2结合情况的影响。结果:第一部分:β-榄香烯对于宫颈癌SiHa细胞和HeLa细胞增殖具有时间和剂量依赖性的抑制作用(P<0.05)。β-榄香烯诱导宫颈癌SiHa细胞和HeLa细胞周期阻滞在G0/G1期,降低细胞分化能力,抑制细胞增殖。β-榄香烯可以促进宫颈癌SiHa细胞和HeLa细胞凋亡且呈剂量依赖性(P<0.05)。β-榄香烯抑制宫颈癌SiHa细胞和HeLa细胞迁移和侵袭能力且呈呈剂量依赖性(P<0.05)。β-榄香烯作用后β-catenin,TCF7,c-Myc,CyclinD1,Bcl-2,MMP-2表达下降,P53表达增高(P<0.05)。第二部分:TGF-β1(10 ng/ml)治疗后宫颈癌细胞形态学细胞增大、延长,呈梭形。4天后细胞形态学改变明显,细胞长度较对照组增加明显,E-cadherin蛋白表达下降,vimentin蛋白表达增加(P<0.05);TGF-β1可以促进宫颈癌细胞增殖,呈时间和剂量依赖性(P<0.05);TGF-β1可以促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭,且呈剂量依赖性(P<0.05)。第三部分:β-榄香烯抑制SiHa和HeLa细胞中TGF-β1诱导的迁移和侵袭能力,且呈剂量依赖性(P<0.05);β-榄香烯通过抑制Sox 2和β-catenin信号转导抑制TGFβ1诱导的SiHa和HeLa细胞的迁移和侵袭;β-catenin蛋白弥漫或者局灶在细胞膜、细胞质或者细胞核中均有表达,在低分化宫颈癌组织中表达明显高于中分化和高分化,差异具有统计学意义(P<0.05)。TCF7蛋白主要在宫颈癌的细胞核中表达,在低分化宫颈癌组织中表达明显高于中分化和高分化,差异具有统计学意义(P<0.05)。Sox2蛋白主要在宫颈癌的细胞核中表达,在低分化宫颈癌组织中表达明显高于中分化和高分化,差异具有统计学意义(P<0.05)。Sox2与β-catenin、TCF7在不同分化程度的宫颈癌组织中表达呈正相关(P<0.05);β-榄香烯可以逆转TGF-β1促进的β-catenin入核作用;β-榄香烯可以通过抑制β-catenin/TCF7/Sox2发挥抗肿瘤的治疗作用。结论:1.β-榄香烯通过抑制Wnt/β-catenin通路诱导宫颈癌SiHa和HeLa细胞周期阻滞到G1期从而抑制细胞增殖,诱导凋亡,抑制迁移及侵袭。2.TGF-β1诱导宫颈癌细胞的上皮间质转化(EMT),促进宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭。3.β-榄香烯通过β-catenin/TCF7/Sox2通路抑制宫颈癌EMT,为预防宫颈癌的侵袭和转移及宫颈癌的治疗提供了新的机制。