论文部分内容阅读
多糖(polysaccharides)，是由10个及其以上的单糖通过糖苷键连接而成的链状聚合物，广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中。它是生物体内除蛋白质、核酸和脂类之外的又一基本物质。多糖相对毒性小，功能广泛，具有非常重要和特殊的生理活性，传统中药是多糖的一个重要来源。本论文以实验室从中药中分离得到的几种多糖为研究对象，开展了两部分的工作:其一是对从金银花中提取得到的多糖LJW0F2的生物活性研究;其二是以从天麻中分离得到的多糖WGE和从灰树花中分离得到的多糖GFPBW1为工具多糖进行中药多糖的口服吸收机制研究。 金银花为一传统中药，主要用于治疗温热发病，风热感冒等。以往对金银花的研究主要集中在绿原酸，黄酮类等小分子物质上，对于金银花中大分子物质-多糖的研究较少。为此，我们分离得到了一种带有支链的α-1，4连接的葡聚糖-LJW0F2，并进一步研究其生物活性。经原子力显微镜(atomic forcemicroscope，AFM)观察，我们发现50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml LJW0F2经体外与β-淀粉样多肽1-42(amyloid proteinβ1-42，Aβ42)孵育21天可明显抑制其纤丝形成和聚集;硫磺素T(Thioflavin T,ThT)结合实验显示LJW0F2可显著抑制抑制Aβ42与硫磺素T的结合，在100μg/ml以上浓度其结合被抑制在20％以下。进一步的CCK-8细胞活力实验(CCK-8 assay)和流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测结果表明，LJW0F2可以明显减弱由老化的Aβ42所致的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的细胞毒性和凋亡，并且Western blotting实验结果表明，LJW0F2可以部分减弱由老化的Aβ42引起SH-SY5Y细胞中剪切形式的caspase-3(cleaved-caspase-3)和其下游的切割底物PARP表达的增加，这一结果进一步验证了我们在CCK-8实验和流式检测中得到的结论。此外，经ELISA检测，我们发现LJW0F2可以显著抑制淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)和淀粉样前体蛋白β-位点剪切酶1(β-site amyloid precursor protein cleavingenzyme1，BACE1)双稳转的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsterovary-CHO/APPBACE1)细胞上Aβ42的分泌，并且LJW0F2可以抑制APP和BACE1在mRNA水平的表达。上述结果表明，LJW0F2可以从抑制Aβ42聚集，神经毒性及分泌两个方面来发挥其在阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)中的作用。 金银花多糖中带支链的α-1，4连接的葡聚糖LJW0F2对AD疾病相关分子的良好干预活性，激发了我们探索中药多糖如何发挥活性的极大兴趣。由于多数中药是通过口服发挥疗效，我们的设想就是中药多糖可能在口服后能被肠道吸收，为此我们选用与金银花多糖LJW0F2结构非常类似的天麻多糖WGE以及作为结构对照的从灰树花中提取的β-1，3连接的葡聚糖GFPBW1为工具多糖对中药多糖的口服吸收及其机制进行了深入研究。首先，建立用于药物吸收研究的人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞转运模型，评价WGE和GFPBW1的口服吸收情况，结果发现两种多糖均能成功跨膜，并且其跨膜前后的保留时间基本不变，进一步计算得到两种多糖的从肠腔侧(apical，AP)到基底侧(basolateral，BL)方向的表观渗透系数(apparent permeability coefficient，Papp)分别为1.990±0.374610-6 cm/s和7.875±0.273910-6 cm/s，均大于110-6 cm/s，从体外模型上证明WGE和GFPBW1可以被小肠上皮细胞吸收，更有意思的是我们在Caco-2模型进行了其他连接方式和带有不同电荷的GFPBW1和WGE的从AP→BL方向的转运实验，结果证明这些多糖的Papp均大于110-6 cm/s，证明这些多糖均能被吸收。接着，WGE，GFPBW1和香菇多糖lentinan在大鼠体内的药代动力学实验发现，口服和静脉注射WGE和GFPBW1后，能在大鼠的血清中检测到多糖，并且WGE和GFPBW1的保留时间跟原糖基本一致，说明多糖基本没有降解，经口服和静脉注射后主要以原型的形式被吸收，而lentinan口服后有部分降解。大鼠口服和静脉给药WGE，GFPBW1和lentinan后，血药浓度-时间曲线采用非房室模型计算药代动力学参数，WGE，GFPBW1和lentinan的达峰时间Tmax分别为2h，5h及2 h;平均清除率(clearance，CL)分别为1.879ml.kg/h，74.84 ml.kg/h及43.5 ml.kg/h;半衰期(half-time，t1/2)分别为8.44 h，1.44h及7.92 h，说明WGE吸收快，消除慢，半衰期较长而GFPBW1吸收慢，消除快，半衰期短，lentinan则介于GFPBW1和WGE之间，经计算WGE, GFPBW1及lentinan的生物利用度(bioavailability, F)分别为63.89％，73.91％及69.47％，显示三种多糖的口服吸收良好，生物利用度较高。由于多糖没有发光基团，我们利用5-二甲氨基萘-1-（N-（2-氨基乙基））磺酰胺(dansyl ethylenediamine，DED)及得克萨斯红(Texas Red)对多糖进行标记以对其示踪研究其在小肠细胞中的吸收。随后，我们在人小肠黏膜上皮细胞HIMC中进行荧光多糖的摄取，结果进一步证实多糖能被小肠细胞摄取，并且当给小鼠口服荧光标记的GFPBW1和WGE后，相对于对照组，给药组小鼠的小肠切片中能观察到明显荧光，以上结果从体外和体内两个方面证实了多糖在小肠细胞上的摄取。石英晶体微天平分析(quartz crystal microbalance，QCM)证实GFPBW1可以跟living HIMC结合。此外，通过免疫荧光实验和RNA干扰技术及特异性的内吞途径阻断剂，我们发现多糖在小肠细胞的摄取是网格蛋白重链(clathrin heavy chain，CLTC)内吞途径而非小窝蛋白(caveolin-1)内吞途径依赖的，并且多糖的摄取还依赖于表皮生长因子受体激酶底物15(Eps15)，Rab5以及发动蛋白1(dynamin1)。利用特异性的信号通路抑制剂，我们发现wnt/β-catenin，NF-κB信号通路及EGFR参与多糖的摄取，此外我们的发现细胞膜上的特异性受体如bone morphogenetic proteinreceptor(BMPR)，type IA(BMPRIA)，dectin-1也分别参与WGE和GFPBW1在小肠上皮细胞的摄取。 综上所述，我们的研究首次发现了LJW0F2的抑制Aβ42聚集和分泌的作用，证实其为抗AD的一个候选化合物。此外，我们的研究首次对中药多糖能否被吸收及其吸收机制进行了系统深入的研究，证实了至少部分外源性的中药多糖可以通过口服被小肠吸收，并且证明多糖的摄取依赖于网格蛋白内吞途径(clathrin-mediated endocytosis)。这一结果颠覆了关于多糖不能被口服吸收的传统论断，为多糖口服的成药性提供了强有力的依据，将对多糖口服制剂的开发和多糖在其他领域的应用提供线索和坚定的理论基础。