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大熊猫是我国特有的珍稀濒危动物,是熊科家族中最为珍稀,也是受到最大生存威胁的哺乳动物之一。大熊猫趋于濒危的主要原因之一是疾病致死,以肠道疾病最为严重。胃肠道的正常菌群是指寄生在动物胃肠道内对机体无害反而有益的一类微生物群落。正常情况下它们的数量和比例处于动态平衡中,在机体的营养消化、免疫、抗毒素、抗癌症等生理活动中发挥着巨大的作用。如果正常菌群的数量和菌群结构发生了变化,就会引发一系列的肠道疾病,严重威胁着大熊猫的健康。
为了探究圈养成年大熊猫在秋季的肠道菌群结构,本实验采用16S rDNA-RFLP技术对中国保护大熊猫研究中心一四川雅安碧峰峡基地的3只圈养成年大熊猫(共五个粪样:TT9、TT10、,TT11、XM1.0、YM10)在秋季肠道菌群的多样性进行了研究。首先以细菌16SrDNA通用引物扩增粪样总细菌16S rDNA基因,构建16S rDNA克隆文库,然后利用内切酶MspⅠ和HinfⅠ进行限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphisma,RFLP)分析聚类,聚类结果再利用α多样性的测度分析RFLP结果。最后选取一部分优势菌群进行测序分析,构建进化树。研究结果表明:
(1)经过构建克隆文库,RFLP聚类以后,TT9、TT10、TT11、XM10、YM10分别得到了57个、48个、30个、35个、52个OTUs,其文库的覆盖率分别为58.33％、67.31％、80.00％、71.88％、68.52％。说明所构建的文库具有很好的代表性。同时也表明大熊猫肠道内细菌具有丰富的多样性。
(2)通过α多样性的测度分析RFLP结果显示,物种的丰度指数(E、dMa、R2)、均匀度指数(JSW)、多样性指数(H、Hmax、Dg)和Chaol物种多样性指数(Schaol)均说明,圈养大熊猫在秋季的肠道细菌多样性以9月份相对较高,而11月份较低。而在成年大熊猫之中,年龄偏小的肠道菌群多样性高于年龄偏大的。大熊猫生活的环境对肠道菌群的多样性也有一定的影响。
(3)经过选取一部分优势菌群进行测序,在NCBI上BLAST以后,用DNAstar构建进化树可知,所测的优势菌群主要归属于3个细菌门:变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。其中变形菌门主要以大肠埃希杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺氏菌属(Shigella)为主,厚壁菌门主要以链球菌属(Streptococcus)为主,而拟杆菌门主要以鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)为主。
(4)其中TT9的肠道菌群主要以Pseudomonas为主(36.11％of total clones),其次为Escherichia(7.4％of total clones),TT10主要以Escherichia为主(12.5％of total clones),TT11主要以Escherichia和Shigella为主(均为21.0％oftotal clones),其次为Streptococcus(12.4％of total clones),XM10主要以Shigella为主(45.8％of total clones),YM10主要以Escherichia为主(13.9％of total clones),其次为Pseudomonas(8.3％of total clones)。