广谱型抗原蛋白GAPDH的免疫保护机制分析及保护效果关键区域的定位

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迟钝爱德华氏菌是一种鱼类致病菌,可以使鱼患腹水病而死亡,对中国的水产养殖业造成了巨大的经济损失,但是到目前为止还没有一种有效的疫苗可以防止鱼类免受迟钝爱德华氏菌的感染。   先前的研究发现GAPDH可以作为一种有效的保护性抗原,针对五种海水养殖鱼类病原菌具有良好的保护作用。为了了解GAPDH的免疫保护机理,本文对迟钝爱德华氏菌的GAPDH编码基因进行了克隆、蛋白表达和纯化。免疫重组GAPDH的大菱鲆经EIB202攻毒后,相对免疫保护率达到60%以上。ELISA结果分析发现免疫后的大菱鲆血清中有显著的特异性抗体产生,血清杀菌活力也明显增强,表明GAPDH可以有效的激发大菱鲆的体液免疫应答。此外,经来源于EIB202的重组GAPDH免疫后的大菱鲆血清与上述的五种病原菌都有明显的交叉反应。   进一步采用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了经重组GAPDH免疫后大菱鲆的肝脏、脾脏和肾脏中免疫相关因子的表达变化,从转录水平上了解GAPDH的免疫保护机理。结果显示三种组织中四种免疫相关因子(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、IL-1β和IgM)在免疫后的表达水平都有所增加,其中肝脏中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ都在免疫后的一天内达到了峰值(分别是对照组的20倍和70倍),脾脏中的IgM在免疫后的第三天达到了峰值(为对照组的14倍),而肾脏中的MHC-Ⅱ在第14天达到了峰值(都为对照组的10倍),这些结果说明在经GAPDH免疫后,可以有效的激发大菱鲆的适应性免疫系统,包括体液免疫和细胞免疫。   最后,分析了GAPDH蛋白免疫保护的关键区域,成功构建了八个部分缺失的GAPDH蛋白编码基因重组表达质粒,并进一步表达和纯化了相关蛋白。经这些蛋白免疫的斑马鱼经EIB202攻毒后,表现出不同的相对免疫保护率,其中累计存活率最低的三个片段分别为GapA(3)、GapA(4)和GapA(5),而这三个蛋白的缺失区域分别为DeletionⅢ(333~489bp)、DeletionⅣ(490~660bp)、DeletionⅤ(661~840bp),这就说明GAPDH免疫保护关键区域可能在333~840bp之间,即111~280AA内。   总之,上述结果为未来开发迟钝爱德华氏菌的亚单位疫苗及GAPDH作为有效的广谱型抗原蛋白提供可靠理论支持。
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