论文部分内容阅读
鲤鱼(Cyprinus carpio)，原产于欧亚大陆，是世界上重要的水产养殖鱼类。为进一步分析研究鲤鱼转录组数据及其功能基因，我们构建了鲤均一化全长cDNA文库。本研究以1龄雌性鲤鱼的八种组织为材料，包括血液、鳃、卵巢、肝胰脏、头肾、体肾、心和脑组织，利用Cap-trapper法，制备成全长Uncut cDNA原始文库。对原始文库进行检测，文库总克隆数（CFU）为6.4×106，重组率大于95%。采用基因组DNA饱和杂交原理，对文库进行均一化处理，从而构建了鲤鱼均一化的全长cDNA文库，CFU为2×105，重组率大于95%，插入片段平均长度大于1.0kb，全长比例大于90%。qPCR检测表明，文库均一化后，β-actin丰度相对于均一化前降低了87倍。对均一化后的文库随机挑取43008个克隆，利用M13F(-20)通用引物进行5’端测序，成功测序并得到29779条序列。序列处理后聚类拼接，获得15116条非重复序列（unigene），并提交至NCBI数据库。对得到的unigene进行长度分布及GC含量分析，序列长度主要分布在300bp-700bp间，平均长度为540bp；GC含量分析表明鲤鱼基因cDNA序列中GC含量为45.53％。基于本地Linux平台，使用BLASTX与无冗余蛋白数据库（NR）进行比对分析，对8437条序列进行了注释，包括分子功能、生物学过程和细胞组分三个层次,其中细胞组分分为13个部分，分子功能分为12个部分，生物学过程分为22个部分。从本文库筛选出3个Rab1a基因，分别为Rab1a-1、Rab1a-2和Rab1a-3。应用鲤BAC文库对Rab1a-1和Rab1a-2进行全长测序及信息学分析，绘制出基因结构图；随后，对它们的蛋白二级及三级结构进行比对作图，并构建系统发育树；最后，分析了Rab1a-1和Rab1a-2在不同组织的表达，以及低氧条件下它们表达的差异并对功能进行初步研究。