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脂多糖(Lipo Lysaccharide,LPS),是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成分,也是引起炎症反应的主要原因。适当的炎症反应有益于身体增加免疫力,但过度的炎症反应会危害人类的身体健康,严重的会引起脓毒症。治疗炎症的药物主要是抗生素。近年来抗生素的滥用导致多种多药耐药菌的产生,对组织和器官也引起了不同程度的损伤。抗菌肽的发现,被认为是可以替代抗生素的新型药物。Temporin-1CEa是从林蛙皮肤分泌物中分离提纯得到的抗菌肽。以Temporin-1CEa为模板将肽链第3位的L-Asp和16位的L-GLy用L-Lys替换,得到抗菌肽LK2(6);并进一步以LK2(6)为模板将LK2(6)疏水面的第8位的L-ALa替换成L-Leu得到抗菌肽LK2(6)A(L),以增加其疏水性。本实验室前期研究发现,Temporin-1CEa及其两个改造肽对革兰氏阳性和阴性细菌具有很高的杀菌活性,对多种肿瘤细胞也有杀死作用,但对正常细胞包括红细胞毒副作用很小,是有应用前景的新型抗生素。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为细胞模型,探讨Temporin-1CEa及两个改造肽的抗炎活性及作用机制。首先采用MTT法测定抗菌肽对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性,并选取使细胞存活率大于80%的抗菌肽的浓度进行接下来的炎症反应实验。小鼠巨噬细胞RAW264.7在LPS诱导后,细胞内炎症因子TNF-α和IL-6的表达量显著增加。加入三种抗菌肽能够抑制两种炎症因子的表达,且抑制呈浓度依赖关系。三个抗菌肽中Temporin-1CEa抑制炎症因子的效果最好。通过RT-q PCR和Western Blot分别检测了抗菌肽对炎症因子以及通路蛋白m RNA表达水平和蛋白水平的影响。结果显示:三种抗菌肽对炎症因子和炎症通路蛋白的表达都有不同程度的抑制,LK2(6)对My D88的表达水平抑制效果最好;Temporin-1CEa对TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α的表达水平抑制效果最好。三种抗菌肽对炎症通路蛋白中p38、ERK、JNK和I-κB蛋白的表达影响不大,但抑制了这些通路蛋白的磷酸化水平,其中Temporin-1CEa对p38、ERK、JNK和I-κB的磷酸化水平抑制最大。激光共聚焦显微镜观察到,抗菌肽Temporin-1CEa、LK2(6)和LK2(6)A(L)能够在短时间内进入细胞内部,但细胞膜电位检测结果表明,抗菌肽在所选的实验浓度下没有明显改变细胞膜的通透性,提示抗菌肽进入细胞是以非破膜的方式进入到细胞内部。通过研究低温和多种内吞抑制剂对抗菌肽,Temporin-1CEa、LK2(6)和LK2(6)A(L)内化的影响,发现三种抗菌肽都是以能量依赖的方式进入细胞的,Temporin-1CEa和LK2(6)A(L),内化主要是通过Na~+/H~+离子通道介导的内吞途径和有丝分裂抑制进入细胞,而LK2(6)内化主要是通过抑制吞噬作用介导的内吞途径进入细胞。