论文部分内容阅读
Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)是一类典型的病原模式识别受体(pattern reorganization receptor，PRR)，通过特异性识别病原微生物的保守分子一病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)启动机体抗感染天然免疫应答过程，对于机体抵抗病原的入侵发挥着极为重要的作用。Toll样受体5(TLR5)是TLRs的重要成员之一，通过识别细菌鞭毛蛋白并与之结合，将抗原信号通过一定的通路传导至胞内，分泌炎性细胞因子，从而起始抗感染天然免疫。虽然对人、小鼠等哺乳动物的TLR5进行了较为深入的研究，但目前对鸭TLR5的结构及其功能知之甚少。据此，本论文主要进行了以下几方面的研究:(1)采用分子生物学技术对番鸭TLR5基因CDS全长进行了克隆和序列测定，对其基因及编码产物进行了分子特征分析;(2)对TLR5在番鸭各组织器官中的表达进行了定量研究;(3)在体内检测了鞭毛菌感染情况下TLR5及相关细胞因子的表达，并且在体外研究了鞭毛蛋白刺激后鸭外周血单核细胞中TLR5及重要信号分子和细胞因子的应答反应。本研究的主要研究方法和结果如下。
1.番鸭TLR5基因的克隆及其分子特征分析
通过对已知鸡、鹅等动物TLR5基因序列的比对分析，在保守区设计了3对引物，利用PCR方法对番鸭TLR5CDS全长进行分段克隆。PCR产物克隆至T载体并进行序列测定，经拼接后获得TLR5全长CDS。运用生物信息学分析软件对番鸭TLR5的基因及其编码产物的分子特性进行分析。结果显示，番鸭TLR5CDS区全长2580bp，预测编码859个氨基酸;由11个LRR、1个LRR-CT和1个TIR组成。同源性比较发现与鹅的氨基酸同源性较高(93.9％)，与翘鼻麻鸭(97.7％)和绿头鸭(99.7％)的氨基酸同源性很高，TLR5在种属内高度保守性。
2.鸭TLR5基因荧光定量RT-PCR方法的建立及其组织定量表达分布
根据获得的番鸭TLR5序列，设计了一对特异性引物，建立了基于SYBRGreen染料法的鸭TLR5荧光定量RT-PCR方法，并运用该方法对健康雏鸭不同组织中TLR5mRNA的表达水平进行了定量分析。结果表明，所建立的荧光定量RT-PCR方法具有很好的敏感性在6×103～6×108copies/μl内具有很好的线性关系，相关系数为0.998，批间和批内变异系数分别为1.02％～1.77％和0.15％～2.0％，具有良好的重复性和再现性。对不同组织中TLR5mRNA的定量表达结果表明，TLR5在番鸭组织器官中广泛分布，在脾脏中表达量最高，其次为肝脏、肺脏和法氏囊。
3.基因定量表达分析中稳定内参基因的筛选
为了筛选稳定内参基因，用于对后续研究中定量PCR数据进行校正。本部分研究建立了ACTB、GAPDH、18S rRNA、ALB、HSP90以及RPL4等6种候选内参基因的荧光定量RT-PCR方法，对大肠杆菌SYW004株感染鸭0h、12h、24h、36h的各组织器官中6个内参基因进行定量检测，计算其Ct值及相对表达量，运用GeNorm软件对各感染组织器官中内参基因的稳定性进行评价和计算所需数目。结果显示，不同组织器官在感染大肠杆菌后内参基因的稳定性存在差别，在肾脏中需要联合使用RPL4、18S rRNA和HSP90三种内参基因来进行PCR数据的校正;脾脏、肺脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、法氏囊中需要联合使用2种内参基因，分别是HSP90、RPL4，18S rRNA、RPL4，RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA和RPL4、HSP90;而在心脏、肝脏、胰腺和脑中只需要1种内参基因进行PCR数据校正即可，分别是HSP90、RPL4、RPL4和18S rRNA。在本研究的后续试验中，按照实验所得的稳定内参基因及所需要的数目对鸭各感染组织器官中PCR数据进行校正，以确保试验数据的真实可靠。
4.大肠杆菌诱导鸭TLR5及相关炎性细胞因子应答的研究
为了探讨鸭TLR5在鞭毛菌感染后引起炎症反应中的作用，用大肠杆菌SYW004株口服感染10日龄健康雏鸭，在感染后不同时间点对13种组织器官中TLR5及TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达进行定量测定，同时进行组织病理学分析。结果显示，在脾脏、法氏囊、十二指肠和盲肠等大多数器官中，TLR5mRNA表达量随感染时间的增加而持续上升;在相应时间点TNF-α、IL-1β基因mRNA的表达量也出现了不同程度上调;感染24h后，IL-6基因mRNA的表达量出现上调。病理组织学分析表明感染后各组织器官均出现不同程度的炎性反应，以脾脏、法氏囊、十二指肠和盲肠出现最早、程度最重。本研究结果表明，感染大肠杆菌后，可引起TLR5及TNF-α和IL-1β炎性细胞因子表达上升，并造成多种组织器官炎症病理损伤。TLR5的表达与引发的炎症反应相关。
5.鸭TLR5介导的抗感染炎性反应信号传导机制研究
制备鸭外周血单核细胞(PBMC)，用鞭毛蛋白刺激PBMC，并在不同时间点利用荧光定量RT-PCR方法测定细胞中TLR5和相关信号通路分子及炎性细胞因子的动态表达量。试验结果表明，鞭毛蛋白刺激4h时TLR5、MyD88、NF-κb、TNF-α、IL-1β表达量出现上调，8h到达峰值，随后下降。本研究结果表明鸭TLR5与鞭毛蛋白特异性识别结合后，经MyD88依赖途径激活机体的抗感染免疫反应。
本论文研究首次成功获得番鸭TLR5的CDS全长，对其分子特征进行了较全面的分析，运用荧光定量RT-PCR方法对番鸭不同组织器官TLR5的表达分布进行了定量研究;首次证实了鸭TLR5的表达与引发的炎症反应相关;TLR5与鞭毛蛋白识别结合后，经MyD88依赖途径，介导了机体抗细菌感染的炎性免疫应答过程。总之，本研究对番鸭TLR5的分子结构和功能进行了较为深入的研究，为最终阐明鸭TLR5在天然抗感染免疫中的作用机制具有重要的意义。
1.番鸭TLR5基因的克隆及其分子特征分析
通过对已知鸡、鹅等动物TLR5基因序列的比对分析，在保守区设计了3对引物，利用PCR方法对番鸭TLR5CDS全长进行分段克隆。PCR产物克隆至T载体并进行序列测定，经拼接后获得TLR5全长CDS。运用生物信息学分析软件对番鸭TLR5的基因及其编码产物的分子特性进行分析。结果显示，番鸭TLR5CDS区全长2580bp，预测编码859个氨基酸;由11个LRR、1个LRR-CT和1个TIR组成。同源性比较发现与鹅的氨基酸同源性较高(93.9％)，与翘鼻麻鸭(97.7％)和绿头鸭(99.7％)的氨基酸同源性很高，TLR5在种属内高度保守性。
2.鸭TLR5基因荧光定量RT-PCR方法的建立及其组织定量表达分布
根据获得的番鸭TLR5序列，设计了一对特异性引物，建立了基于SYBRGreen染料法的鸭TLR5荧光定量RT-PCR方法，并运用该方法对健康雏鸭不同组织中TLR5mRNA的表达水平进行了定量分析。结果表明，所建立的荧光定量RT-PCR方法具有很好的敏感性在6×103～6×108copies/μl内具有很好的线性关系，相关系数为0.998，批间和批内变异系数分别为1.02％～1.77％和0.15％～2.0％，具有良好的重复性和再现性。对不同组织中TLR5mRNA的定量表达结果表明，TLR5在番鸭组织器官中广泛分布，在脾脏中表达量最高，其次为肝脏、肺脏和法氏囊。
3.基因定量表达分析中稳定内参基因的筛选
为了筛选稳定内参基因，用于对后续研究中定量PCR数据进行校正。本部分研究建立了ACTB、GAPDH、18S rRNA、ALB、HSP90以及RPL4等6种候选内参基因的荧光定量RT-PCR方法，对大肠杆菌SYW004株感染鸭0h、12h、24h、36h的各组织器官中6个内参基因进行定量检测，计算其Ct值及相对表达量，运用GeNorm软件对各感染组织器官中内参基因的稳定性进行评价和计算所需数目。结果显示，不同组织器官在感染大肠杆菌后内参基因的稳定性存在差别，在肾脏中需要联合使用RPL4、18S rRNA和HSP90三种内参基因来进行PCR数据的校正;脾脏、肺脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、法氏囊中需要联合使用2种内参基因，分别是HSP90、RPL4，18S rRNA、RPL4，RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA,RPL4、18S rRNA和RPL4、HSP90;而在心脏、肝脏、胰腺和脑中只需要1种内参基因进行PCR数据校正即可，分别是HSP90、RPL4、RPL4和18S rRNA。在本研究的后续试验中，按照实验所得的稳定内参基因及所需要的数目对鸭各感染组织器官中PCR数据进行校正，以确保试验数据的真实可靠。
4.大肠杆菌诱导鸭TLR5及相关炎性细胞因子应答的研究
为了探讨鸭TLR5在鞭毛菌感染后引起炎症反应中的作用，用大肠杆菌SYW004株口服感染10日龄健康雏鸭，在感染后不同时间点对13种组织器官中TLR5及TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达进行定量测定，同时进行组织病理学分析。结果显示，在脾脏、法氏囊、十二指肠和盲肠等大多数器官中，TLR5mRNA表达量随感染时间的增加而持续上升;在相应时间点TNF-α、IL-1β基因mRNA的表达量也出现了不同程度上调;感染24h后，IL-6基因mRNA的表达量出现上调。病理组织学分析表明感染后各组织器官均出现不同程度的炎性反应，以脾脏、法氏囊、十二指肠和盲肠出现最早、程度最重。本研究结果表明，感染大肠杆菌后，可引起TLR5及TNF-α和IL-1β炎性细胞因子表达上升，并造成多种组织器官炎症病理损伤。TLR5的表达与引发的炎症反应相关。
5.鸭TLR5介导的抗感染炎性反应信号传导机制研究
制备鸭外周血单核细胞(PBMC)，用鞭毛蛋白刺激PBMC，并在不同时间点利用荧光定量RT-PCR方法测定细胞中TLR5和相关信号通路分子及炎性细胞因子的动态表达量。试验结果表明，鞭毛蛋白刺激4h时TLR5、MyD88、NF-κb、TNF-α、IL-1β表达量出现上调，8h到达峰值，随后下降。本研究结果表明鸭TLR5与鞭毛蛋白特异性识别结合后，经MyD88依赖途径激活机体的抗感染免疫反应。
本论文研究首次成功获得番鸭TLR5的CDS全长，对其分子特征进行了较全面的分析，运用荧光定量RT-PCR方法对番鸭不同组织器官TLR5的表达分布进行了定量研究;首次证实了鸭TLR5的表达与引发的炎症反应相关;TLR5与鞭毛蛋白识别结合后，经MyD88依赖途径，介导了机体抗细菌感染的炎性免疫应答过程。总之，本研究对番鸭TLR5的分子结构和功能进行了较为深入的研究，为最终阐明鸭TLR5在天然抗感染免疫中的作用机制具有重要的意义。