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脑缺血/低氧性损伤是很多神经系统重大疾病的共同病理生理过程,其中神经细胞凋亡在脑缺血/低氧性神经功能损伤中扮演着重要角色。脑缺血/低氧预适应(ischemic/hypoxic preconditioning,I/HPC)是一种内源性保护机制,指亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发器官组织对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。这一现象最初于1986年由美国学者Murry等人在心脏组织中发现,随后人们又在脑、肺、肝和肾等组织器官中观察到了类似现象。大量研究表明,I/HPC可有效地减小缺血梗死体积,提高神经行为学表现,并使一系列凋亡相关蛋白表达及活性发生改变,最终使细胞凋亡减少,起到了一定的脑保护作用。在这一过程中,BCL-2家族的成员BCL-xL蛋白发挥了主要的抗凋亡作用。实验表明,I/HPC可通过提高抗凋亡蛋白BCL-xL的表达来抑制凋亡。我实验室以往研究发现,脑HPC可明显减轻MCAO所致脑缺血性损伤,即减小缺血梗死体积,降低梗死区密度值；同时,缺血脑皮层组织内p38 MAPK磷酸化水平有所提高,提示p38MAPK的激活可能参与了脑HPC对缺血脑的保护作用。然而,P38 MAPK是否通过BCL-xL减少神经细胞凋亡参与HPC的脑保护作用,目前尚不明确。本实验利用已建立小鼠HPC和脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)引起的局灶性缺血模型,通过原位末端标记法(TUNEL)染色和蛋白印迹(Westernblot)技术,观察HPC对小鼠皮层局灶性缺血引起的神经细胞凋亡情况和抗凋亡蛋白BCL-xL的表达的影响；应用p38 MAPK抑制剂SB203580探讨p38 MAPK在HPC保护缺血脑组织中的作用；并利用免疫沉淀技术探讨p38 MAPK与BCL-xL之间的相互作用。所获研究结果将进一步丰富人们对脑I/HPC信号转导机制的认识。
实验在室温20～22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(18～22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NmPublication No.80-23)进行。实验动物随机分为4组:常氧假手术(NS)、常氧缺血(NI)、HPC后假手术(HS)和HPC后缺血(HI)组。小鼠在HPC后1h,进行MCAO缺血模型的制备。手术后6h处死动物,收集缺血核心区(Ic)、半影区(P)和缺血对侧皮质(C)组织,进行胞浆和线粒体蛋白成分的提取。应用Western blot方法分析HPC对皮层组织内抗凋亡蛋白BCL-xL在线粒体和胞浆中表达的影响；同时,应用TUNEL染色观察HPC对小鼠皮层半影区神经细胞凋亡的影响。进一步利用侧脑室注射p38 MAPK抑制剂SB203580,检测p38 MAPK在神经细胞凋亡中的作用。同时,利用免疫沉淀技术检测p38 MAPK与BCL-xL之间是否存在相互作用。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理,并以均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p<0.05为差异显著。实验结果如下:
1.随着低氧暴露次数的增加,小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长
与低氧暴露1次(H1,16.7±1.8min)相比,重复低氧暴露2次(H2,22.6±3.2min)、3次(H3,27.6±4.4min)和4次(H4,30.8±4.3min)小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05,n=43),提示本实验成功地制备了小鼠HPC模型。以下HPC小鼠特指低氧暴露4次的小鼠。
2.HPC对MCAO缺血皮层半影区内神经细胞凋亡的影响
TUNEL染色结果显示,缺血6h后,小鼠皮层缺血半影区内TUNEL阳性细胞数目(9.6±1.2％)较对照组(1.0±0.1％)明显增加(n=3,p<0.05),而HPC预处理(4.5±0.7％)可明显降低半影区内TUNEL阳性细胞数(n=3,p<0.05)。通过Hoest染色统计细胞总数发现,各组小鼠缺血皮层半影区的细胞总数并无明显变化。结果表明,HPC可明显降低MCAO所致小鼠大脑皮层半影区神经细胞凋亡。
3.HPC对MCAO缺血皮层内BCL-xL胞浆和线粒体成分中分布的影响
在正常细胞中,BCL-xL在胞浆中和线粒体成分中均有表达。缺血6h后,脑缺血皮层核心区组织中的BCL-xL蛋白水平均有所减少。而HPC可改变缺血半影区内抗凋亡蛋白BCL—xL在胞浆和线粒体成分中的分布:在线粒体成分中增多(n=6,p<0.05)而胞浆成分中减少(n=6,p<0.05)；但对梗死区BCL-xL蛋白的分布没有影响(n=6,p>0.05)。
4.P38 MAPK抑制剂对HPC缺血脑皮层半影区内神经细胞凋亡的影响
HPC后1h,即MCAO模型制备前,进行侧脑室注射p38 MAPK抑制剂SB203580,发现缺血皮层半影区内TUNEL阳性细胞显著增多(8.0±0.6％,n=3,p<0.05),DMSO为溶剂对照(4.4±1.0％)。
5.P38 MAPK抑制剂对HPC缺血脑皮层内BCL-xL胞浆和线粒体成分中分布的影响
侧脑室p38 MAPK抑制剂SB203580明显地抑制了缺血皮层半影区组织中BCL-xL的线粒体转位,即线粒体成分中BCL-xL蛋白水平下降(n=4,p<0.05),胞浆成分中BCL-xL蛋白水平升高(n=4,p<0.05)。
6.BCL—xL和P38 MAPK之间的相互作用
利用免疫沉淀技术发现,正常小鼠脑皮层组织内全细胞匀浆中和BCL-xL抗体沉淀产物中,均可检测出p38 MAPK特异性条带；IgG抗体作为阴性对照,其沉淀产物中无p38 MAPK特异性条带。结果表明,p38 MAPK与BCL-xL之间可能存在相互作用。
总之,本研究发现HPC可明显减少缺血皮层半影区神经细胞凋亡,提高线粒体内BCL-xL蛋白水平。在此基础上,我们进一步发现p38 MAPK参与了HPC降低小鼠缺血脑皮层半影区内神经细胞凋亡、提高BCL-xL的线粒体转位的保护作用；且p38 MAPK与BCL-xL之间可能存在相互作用。本研究所获成果不仅丰富了人们对脑I/HPC信号转导机制的认识,也为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供一定的实验依据。