苯丙氨酸二肽类化合物Y101抗乙肝病毒的研究

• 作 者: 王晨吟
• 机 构: 贵阳中医学院
• 出 处: 贵阳中医学院
• 发表日期: 2013年期
• 关键词: 马蹄金素衍生物 苯丙氨酸二肽类化合物 乙肝病毒 作用机制

目的:研究马蹄金素衍生物苯丙氨酸二肽类化合物Y101对拉米夫定恩替卡韦耐药病毒基因、乙肝病毒前基因组RNA以及鸭乙肝病毒的影响作用。　　方法:1.表型耐药实验(1) Y101对HepG2 A64细胞的毒性实验:用96孔板接种A64细胞24小时后，加7种不同浓度Y101药液(160、80、40、20、10、5、2.5μg/ml)，培养72小时后用MTT法测定OD值，并计算Y101的半数有毒浓度(CC50)以及最大无毒浓度。(2)在Y101最大无毒浓度以下(40μ g/ml)，设40、20、10、5、2.5μg/ml5个浓度组、替诺福韦阳性对照组以及拉米夫定和恩替卡韦对照组。培养96小时后收集细胞，提取病毒DNA，荧光定量PCR检测各药物组DNA表达量。2.乙肝病毒前基因组RNA实验(1) Y101对HepG22.2.15细胞的毒性实验:用96孔板接种2.2.15细胞24小时后，加7种不同浓度Y101药液（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml），培养72小时后用MIT法测定OD值，并计算Y101的半数有毒浓度(CC50)以及最大无毒浓度。(2)在Y101最大无毒浓度以下（50μg/ml），设50、25、12.5μg/ml药物浓度组以及拉米夫定阳性对照组。培养72小时后收集细胞，提取总RNA，反转录后进行荧光定量PCR检测各药物浓度组前基因组RNA表达量。3.Y101对鸭乙肝病毒的影响(1)体外实验:在无菌操作的环境中对雏鸭灌流，分取原代肝细胞，待细胞贴壁后加入80、60、40、20、10μg/ml的Y101药液，培养96h后提取DNA荧光定量检测DNA表达量。(2)体内试验:90只感染DHBV的北京雏鸭随机分为对照组，Y101剂量组和拉米夫定组，各组雏鸭于给药前(d0)、给药5天(d5)、10天(d10)及停药后3天(P3)经腿胫静脉取血，分离血清，斑点杂交法测定鸭血清中DHBV-DNA的含量。　　结果:1.表型耐药实验(1) Y101对HepG2 A64细胞的半数有毒浓度为130.60μg/ml，药物浓度在40μg/ml时对细胞没有明显毒性。(2) Y101对于拉米夫定恩替卡韦耐药的细胞依然有较强的抑制病毒复制的作用。Y101作用于A64的EC50为19.47μg/ml，药物浓度在40μg/ml时HBV病毒的抑制率为67.69％。2.乙肝病毒前基因组RNA实验(1) Y101对HepG22.2.15细胞的半数有毒浓度为180.70μg/ml，药物浓度在50μg/ml时对细胞没有明显毒性。(2) Y10150μg/ml、25μg/ml以及12.5μg/ml对HBV pgRNA载量没有明显抑制作用。3.Y101对鸭乙肝病毒的影响Y101高浓度剂量组对鸭肝细胞内以及上清液中的DHBV-DNA抑制率分别为72.40％和52.24％(P＜0.01)。在体内抗病毒实验中，Y101显示了较为持久的抗病毒活性，停药三天后对DHBV-DNA的抑制作用强于阳性对照药拉米夫定。　　结论:(1)临床常见的拉米夫定恩替卡韦耐药突变位点(rtL180M+rtM204V+rtT184L)对Y101依然敏感;(2) Y101抗HBV作用的机制可能发生在HBV复制的转录环节之后。(3) Y101可以有效的抑制体内外DHBV-DNA的表达，抗病毒作用明显。