乙醇对人骨髓间充质干细胞神经肽及凋亡相关基因表达的影响

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背景:近年来乙醇导致股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的临床报道日渐多见,现在已成为非创伤性股骨头坏死的重要诱因,但确切病理学机制仍不完全清楚。研究发现,人骨髓中存在一种骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenclymal stem cells,hBMSCs), hBMSCs具有多向分化潜能,在特定的条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等,这种分化受多种神经递质影响,人骨髓中存在的某些神经递质具有促进成骨和成血管作用,能够促使hBMSCs向骨组织或血管组织分化,保持正常的骨代谢。凋亡是自然的生理过程,由于内外环境激发所致细胞自身主动、有序的死亡方式,过程涉及精确的基因转录和蛋白质合成。半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)作为凋亡重要的效应蛋白,其活性测定成为凋亡相关研究的重要指标。于此同时,B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)作为一种调节细胞凋亡的重要基因,具有抑制凋亡作用。目的:观察在乙醇作用下人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中降钙素基因相关肽受体(CGRPR)、凋亡相关基因bcl-2和caspase-3、过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPAR-γ)、及成骨转录因子(Runx2) mRNA表达的变化。方法:使用密度梯度离心贴壁培养获得hBMSCs,流式细胞仪鉴定后传至第3代,随机分为实验组及对照组,实验组加入浓度为0.09mo1/L-醇,对照组正常培养。培养11天后,采用实时定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)分析两组神经肽受体CGRPR、PPAR-γ、Runx2及凋亡相关基因bcl-2、 caspase-3mRNA的表达。结果:1.原代细胞接种24h后,大量类圆形或多角形细胞贴壁。72h后出现梭形贴壁细胞及细胞集落,胞质丰富伸出突起、核居中。3~11d贴壁细胞明显增多,细胞集落持续增大并逐渐融合,细胞呈漩涡状、辐射状平行排列,细胞界限不清。对原代培养的hBMSCs细胞进行流式细胞仪检测细胞表面标志物结果显示,CD44、CD29阳性表达率分别为(94.2±0.5)%、(92.3±0.7)%,而CD45、CD34表达率分别为(5.6±0.5)%、(2.7±0.8)%,结果表明本研究分离培养细胞为hBMSCs。2.实验组CGRPR、Runx2、 bcl-2mRNA表达较对照组降低,CGRPR (1.90E-01±4.12E-02vs3.27E-01±8.24E-02, t=6.66, p<0.05)、Runx2(1.28E-01±3.18E-02vs2.50E-01±5.33E-02, t=8.80, p<0.05)、bcl-2(1.65E-01±3.98E-02vs2.95E-01±6.78E-02, t=7.35,p<0.05), caspase-3mRNA与PPAR-γ mRNA表达较对照组增高,Caspase-3(5.27E-01±1.26E-02vs3.17E-01±7.46E-02, t=6.39, p<0.05)、PPAR-γ (2.90E-01±6.74E-02vs1.15E-01±3.36E-02, t=10.38,p<0.05),差异有统计学意义。结论:乙醇能够下调hBMSCs申经肽因子、抗凋亡基因、成骨基因表达,上调凋亡基因、成脂基因表达,抑制细胞成骨分化,导致成脂分化、细胞凋亡,这可能与股骨头坏死的发病机制有关。
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